心肌梗身后骨髓间充质干细胞治疗改良心功能及心肺苏醒结果的研究Word格式文档下载.docx

1、并在心肺苏醒72 h 后取心肌组织进行病理切片检查。【结果】与注射磷酸缓冲液相较，注射MSC 2周（67%4% vs 56%5%，P ）及4周后（67%6% vs 5313%，P ）射血分数明显提高，心肺苏醒前后的血液动力学参数包括心脏指数、dp/dt40、-dp/dt、左心室舒张末期压明显改善；尽管2组的苏醒成功率没有明显区别，但72 h生存率2组比较有明显不同（ vs ，P ）。心肌组织病理切片发觉有大量的PKH26标记的细胞存在。【结论】心肌梗身后MSC医治能明显改善心功能，同时也能明显改善心肺苏醒前后的血流动力学参数及72 h生存时刻。 【关键词】 骨髓间充质干细胞； 心室哆嗦； 心跳

2、骤停； 心肺苏醒； 心肌梗死； 射血分数； 心功能 Abstract: 【Objective】 To investigate myocardial function and outcome of cardiopulmonary resuscitation （CPR） in a rat model of myocardial infarction treated with bone marrow mesenchymal stem cells. 【Methods】 A thoracotomy was performed in 18 rats. Myocardial ischemia was ind

3、uced by ligation of the left anterior descending artery （LAD）. 4 weeks later, animals were randomized to receive 5106 MSCs marked with PKH26 in phosphate buffer solution （PBS） or PBS alone as a placebo. Four weeks after MSCs or PBS injection, ventricular fibrillation （VF） and CPR were performed. Eje

4、ction fraction （EF） was quantitated two and four weeks after administrating MSCs or PBS. Hemodynamics, including cardiac index （CI）, dp/dt40, dp/dt, and LVDP were measured before inducing VF and hourly following return of spontaneous circulation （ROSC）. MSCs were counted in 5 ?滋m sections obtained f

5、rom each harvested heart with cryostat. 【Results】 Significant improvements in EF, CI，dp/dt40，-dp/dt，LVDP followed injection of MSCs prior to inducing VF. Following ROSC, myocardial function and hemodynamic were significantly greater in animals treated with MSCs. Duration of survival were significant

6、ly longer in MSCs-treated animals compared PBS-treated animals. 【Conclusion】 Myocardial function before and after CPR and survival time after CPR were significantly improved in animals treated with MSCs compared to those which received PBS. Key Words: bone marrow mesenchymal stem cells; ventricular

7、fibrillation; cardiac arrest; cardiopulmonary resuscitation; myocardial infarction; ejection fraction; myocardial function 近几年来，细胞医治学的进展超级迅猛，利用细胞移植的方式来增加有功能的心肌细胞的数量，从而改善心功能已成为心血管疾病医治的新途径 1，2。以前的心肺苏醒（cardiopulmonary resuscitation，CPR）研究利用的均是健康的动物，且研究的重点放在苏醒后药物的选择及各类器械如何改良苏醒后血流动力学3，4。但临床实际情形是在CPR发生之前病

8、人大多有严峻的心脏疾病5，因此本课题研究力图尽可能接近临床实际，第一结扎左冠状动脉前降支（left anterior desending artery，LAD），造成较严峻的心肌缺血及缺血后心功能不全，4周后注射骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCS）或磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS），医治的干与方法提到了CPR之前，医治4周后再诱发心室哆嗦（ventricular fibrillation，VF）及进行CPR，观看心肌梗身后MSCS医治对大鼠心功能及CPR前后血流动力学的阻碍，从而为MSCS医治

9、心肌缺血及改善CPR的结果提供实验依据。本研究不仅探讨MSCS改善心肌梗身后心功能不全，而且是第一次探讨心肌梗身后MSCS医治对其后发生的心跳骤停和心肺苏醒的血流动力学及生存时刻的阻碍。 1 材料与方式 实验动物和细胞 成年Sprague-dawley雄性大鼠，68个月大小，体质量450550 g。 P3代经PKH26（美国Sigma Aldrich公司）染色的MSC。 要紧仪器及材料 红外线CO2监测仪（型号IL200，美国Instrumentation Laboratory公司），小动物呼吸机（型号3500H，美国Sechrist公司），惠普超声心动图机（型号2406A，美国Hewlett

10、-Packrad公司），除颤仪（型号Smart，美国Philips公司），监护仪（型号7010，美国Tram公司），CODAS 数据搜集系统（美国DataQ公司），高敏压力转换器（型号42584-01，美国Abbott Critical Care Systems公司）。PE-50的塑料导管 （Intramedic PE-50, 美国Becton-Dickinson公司），4-F 塑料导管 （model C-PMS-401J, 美国Cook Critical Care公司）。 13 实验方式 131 大鼠骨髓MSC的分离、培育、传代、鉴定、染色 取1月龄Sprague-Dawley大鼠，在无菌条

11、件下警惕掏出双侧股骨和胫骨，加入10 mL DMEM 完全培育液，无菌注射器反复冲洗骨髓腔，将冲洗后制成的细胞悬液，600g离心5 min，从头加入L-DMEM完全培育液10 mL悬浮细胞后，移入25 cm2塑料培育瓶中，二氧化碳培育箱中37 恒温原代培育（P0）。以后每3 d改换一次完全培育液。当细胞附壁生长至整个底层瓶壁的90%以上时，用%胰蛋白酶消化后按1 2比例传代（为P1代）。倒置显微镜逐日观看，重复上述操作，并记为P二、P3代。P3的细胞将用于所有的动物实验。 取生长良好的P3代细胞，加入胰蛋白酶消化，用PBS洗涤3次，加入荧光标记抗体，4 孵育30 min，PBS洗去未标记抗体，

12、1%多聚甲醛固定15 min，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记CD11b/c，CD29，CD44H，CD45，。 取生长良好且已长满瓶底的P3代细胞（细胞总量为1107个），加入胰蛋白酶消化，600g离心5 min后，用PBS洗涤一次，再600g离心10 min，用移液枪将PBS吸除干净（剩余量 25 mL），加入PKH26细胞专用液体 mL，制成细胞悬液，迅速加入预先已预备好的已加入1L荧光物质的PKH26细胞专用液体 mL中，混合孵育4 min，加入1%小牛血清蛋白1 mL，终止染色1 min，再加入完全培育液2 mL，600g离心10min，去除上清，加入完全培育液10 mL悬浮细胞，

13、改换新的离心管，洗涤细胞共3次，显微镜下观看染色成效。 132 大鼠心肌缺血模型的制备 18只Sprague-Dawley大鼠随机分为实验组和对照组，每组9只动物。在手术的前晚禁食，但可自由进水。手术当天按45 mg/kg给予腹腔内注射喷妥巴比妥麻醉。将手术及电击部位的毛剃干净。用14 g的穿刺针套管作为气管导管插入，用线固定于嘴部皮肤，避免脱出。置一呼气末CO2探测导管于气管导管和呼吸机导管之间，用红外线CO2分析仪监测呼气末CO2分压（PETCO2）。调整呼吸机至工作状态，潮气量为 mL/kg ，呼吸频率为100 次/分，FiO2=。 利用非侵入性经胸壁超声心动图测量基础心功能后开始机械通

14、气。从左侧第4肋间打开胸腔，暴露心脏。用镊子撕高兴包膜，清楚暴露左前降支冠状动脉。用带5/0细尼龙丝线的小圆针缝扎左前降支冠状动脉（left anterior descending coronary artery，LAD）。 关胸前放入一细塑料软管，便于关胸后引流和吸取气体和渗出的血液。 LAD缝扎成功的标记是肢体心电图ST段明显举高，QRS波宽大畸形。关胸后继续机械通气并周密观看EKG 和CO2波形1 h，如有VF发生，当即利用2焦的电能量电击除颤，直到心电图转复为窦性心率为止。1 h后停止机械通气，拔除引流管，按160 mg/kg肌肉内注射抗菌素头孢唑啉及止痛药Ketorolac mg/k

15、g。 动物苏醒后拔除气管导管，放回笼内继续喂养。 14 实验进程 动物模型制备成功4周后，动物从头麻醉。行气管插管并监测PETCO2。用无创超声心动图检查结扎LAD的心功能。随后该动物进行第2次开胸手术同意PKH26标记的5106/ mL MSC 或等量的PBS从梗死心肌局部注射。放置引流软管、关胸、注射抗菌素及止痛药均与模型制备时期相同。 注射MSC 或PBS 4周后， 动物被再次麻醉。行气管插管并PETCO2。游离右颈动脉， 用PE-50塑料导管插入抵达左心室内, 利用高灵敏性的压力传感器，用于测量左心室舒张末期压（LVDP）、左心室收缩压力上升到40 mmHg时的上升速度 （dP/dt40） 和左心室舒张末期压 （-dP/dt）。 游离右颈外静脉，用型号为 4-F 塑料导管插入，通过上腔静脉抵达右心房，一根尖端导电的绝缘电极由该套管插入，直到由该电极