60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应.docx

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60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应

60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应

　　作者：

刁瑞英,宋良文,王少霞,李明

【摘要】　　目的:

探讨60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应。

方法:

原代分离肺内II型上皮细胞（ATⅡ）和间质细胞包括巨噬细胞和成纤维细胞,分别进行0、3、5、7Gy的γ射线照射,用细胞核嗜银染色观察照射对ATⅡ增殖的影响;用酶谱分析检测照射后ATⅡ和间质细胞培养上清中基质金属蛋白酶2、9的活性;用ELISA检测间质细胞培养上清中TGFβ1和IV型胶原含量。

结果:

ATⅡ的核仁数量随照射剂量增加而增多,其中7Gy组最高;ATII培养上清中MMP2、9活性随照射剂量增加呈先增高后降低趋势,间质细胞上清中MMP2、9活性和TGFβ1水平逐渐升高,IV型胶原分泌水平呈先降低后升高趋势。

结论:

放射性肺损伤早期,ATⅡ、巨噬细胞和成纤维细胞均参与肺组织无效性重建过程,与晚期肺纤维化启动有一定的内在联系。

【关键词】肺泡II型上皮细胞间质细胞MMPsTGFβ1IV型胶原

　　[Abstract]AIM:

Toexplorethebiologicaleffectof60CoγrayonalveolartypeⅡcellsandinterstitialcellsofalveoliarseptum.METHODS:

AlveolartypeⅡcellsandinterstitialcellsincludinginterstitialmacrophagesandfibroblastswereirradiatedby0,3,5,7Gyofγrayrespectively.TheeffectofirradiationonATⅡproliferationwasobservedbyargentationagainstnucleus.TheactivityofMMP2,9insupernatantsfromATⅡandinterstitialcellsafterirradiationwasdeterminedbyzymography.ThelevelsofTGFβ1andcollagentypeIVinsupernatantfrominterstitialcellsafterirradiationweremeasuredbyELISA.RESULTS:

ThenucleolusnumberofATⅡwasincreasedwiththeincreaseofirradiationdoseandgroup7Gyreachedthehighestlevel.TheactivityofMMP2,9insupernatantfromATⅡafterirradiationincreasedatfirstandthendecreasedgradually.TheactivityofMMP2,9andthecontentofTGFβ1ininterstitialcellsincreasedstepbystep,butcollagentypeIVdecreasedatfirstandthenincreased.CONCLUSION:

ATⅡ,macrophagesandfibroblastsareallinvolvedinpulmonaryinvalidremodelingcourseinearlyradiationpulmonaryinjury,whichisrelatedtotheinitiationofpulmonaryfibrosisinlateperiod.

　　[Keywords]alveolartypeⅡcell;interstitialcell;MMPs;TGFβ1;collagentypeIV

　　放射性肺损伤和肺纤维化为临床常见并发症,其发生机制尚未完全明了,因此有效防治较为困难[1]。

肺损伤早期的形态学改变主要是肺泡基底膜Ⅳ型胶原降解,继发引起成纤维细胞增生及Ⅳ型胶原再度增多,常导致肺重建发生。

基质中IV型胶原合成和降解平衡失调可能与晚期肺纤维化的启动有关。

基质金属蛋白酶2和9（Matrixmetalloproteinase2,9,MMP2,9）是IV型胶原特异性降解酶。

多种细胞参与了肺损伤重建过程,其中肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞在肺损伤重建和纤维化发生中起重要作用。

本研究拟原代分离上述细胞,探讨60Coγ射线对肺内细胞的生物学效应以及在早期肺损伤重建中的作用,揭示放射性肺损伤与肺纤维化之间的内在联系。

　　1材料和方法

　　材料Wistar大鼠由军事医学科学院动物中心提供;新生小牛血清购于杭州四季青生物工程研究所;RPMI1640培养基、DNase、大鼠IgG、TritonX100购于Sigma公司;小鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体（mAb）购于北京中杉金桥生物科技有限公司;兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体购于博士德公司。

　　方法

　　ATⅡ和间质细胞原代分离参照Dobbs等的方法,　g/L胰蛋白酶消化和剪碎肺组织,将细胞悬液加入大鼠IgG包被的培养瓶,37℃孵育3h,贴壁细胞为巨噬细胞和Fb混合体,将漂浮细胞离心8min获得ATⅡ。

锇酸染色鉴定ATⅡ。

　　细胞处理将接种ATⅡ的培养瓶随机分为0、3、5、7Gy4组,每组3瓶,分别进行γ射线照射,继续培养48h后收集上清,4℃3000r/min离心10min,同时制备细胞爬片。

间质细胞的处理同上。

　　照射后ATⅡ的增殖分析爬片入水,将染液滴于其上1h,封片后图像分析,在400倍下每组取10个视野,测定每个视野的颗粒个数及颗粒面积,求出平均吸光度值。

　　培养上清MMP2、9活性检测参照文献,将ATⅡ和间质细胞上清进行SDSPAGE电泳、洗脱、漂洗、孵育、染色及脱色,成像分析条带面积和灰度;MMP2、9活性＝条带面积×。

　　间质细胞上清TGFβ1和IV型胶原测定

（1）TGFβ1:

上清倍比稀释,双平行孔,37℃2h,BSA37℃封闭2h,TGFβ1多克隆抗体（1∶50）37℃30min,HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10000）37℃30min,TMB37℃显色15min,2mmol/L硫酸终止反应;在450nm处检测吸光度A值;

（2）IV型胶原:

同上,一抗为小鼠抗Ⅳ型胶原mAb,二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG。

　　统计学处理应用统计软件进行数据处理,平均吸光度A值以x±s表示,组间差异比较采用t检验。

　　2结果

　　ATⅡ分离和鉴定每只大鼠可分离2×107ATⅡ,锇酸染色显示胞质内含有嗜锇板层小体,细胞纯度85%。

　　照射对ATⅡ增殖的影响照射后ATⅡ内核仁增多,其中3、5及7Gy组的平均A值较0Gy组分别增加了%、%及%,7Gy组核仁增多最明显。

　　图1照射后ATⅡ核仁的相对含量

　　Fig1NucleolusnumberofATⅡafterirradiation（Argentation）

　　,　vs0Gygroup.

　　细胞上清MMP2、9活性

（1）在ATⅡ上清中,3和5Gy组MMP2活性较0Gy组分别增加%、%,7Gy组较0Gy组降低%;3、5及7Gy组MMP9活性较0Gy组分别增加%、%和%。

（2）在间质细胞上清中,3、5和7Gy组MMP2活性较0Gy组分别增加%、%和%;MMP9活性较0Gy组分别增加%、%及%。

　　图2照后ATⅡ和间质细胞上清MMP2、9活性（图像分析）

　　Fig2ActivitiesofMMP2,9insupernatantfromATⅡ（A）andinterstitialcells（B）afterirraidiation

　　,　vs0Gygroup.

　　间质细胞上清TGFβ1含量照射后上清中TGFβ1含量出现不同程度的增高,其中3、5及7Gy组较0Gy组分别增高2%、%及%,5和7Gy组均具有统计学意义（图3）。

　　图3间质细胞上清TGFβ1含量

　　Fig3ThelevelofTGFβ1insupernatantfrominterstitialcells

　　,　vs0Gygroup.

　　间质细胞上清IV型胶原含量上清中IV型胶原含量随照射剂量增加呈先降低后增高趋势,其中3和5Gy组较0Gy组分别降低%和%（）,而7Gy组较0和5Gy组增加了%（）和100%（）,均具有统计学意义（图4）。

　　图4间质细胞上清IV型胶原含量变化

　　Fig4ThelevelofcollagentypeIVinsupernatantfrominterstitialcells

　　,　vs0Gygroup.

　　3讨论

　　肺内AM和Fb胞膜表面含有IgG的Fc段受体,能与IgG的Fc段结合,而ATⅡ表面则缺乏Fc段受体。

根据这一原理,本实验采用免疫黏附选择法,将原代肺组织细胞悬液培养于被覆IgG的平皿中,有Fc段受体的AM和Fb被黏附贴壁,而无Fc段受体的ATⅡ得以分离,可分别获得II型细胞和肺泡壁间质细胞用于放射性肺损伤机制探索。

ATⅡ作为肺泡壁重要的结构细胞,能修复受损的肺泡I型上皮,合成基底膜物质和IV型胶原。

ATⅡ向肺泡I型上皮的转化过程是由TGFβ1通过Smad信号转导途径介导的。

ATⅡ的增殖与凋亡在急性肺损伤和放射性肺纤维化的发生中至关重要。

有实验表明,在博来霉素致肺纤维化早期,ATⅡ中MMP2基因转录明显上调。

ATII还可产生MMP9,后者与MMP2共同参与受损肺组织重建过程。

ATII在放射性肺损伤中对照射的反应尚不完全清楚,本实验通过细胞核嗜银蛋白染色分析发现,ATⅡ的核仁随照射剂量增加而增多,这与对大鼠单侧胸部照射致肺纤维化模型的病理变化相一致,表明γ射线照射能促进肺泡ATII异常增殖。

明胶酶谱分析发现,小剂量射线照射后,ATII中MMP2、9的酶活性明显增高,但随照射剂量增加呈逐渐下降趋势,甚至低于正常对照水平。

提示一定范围剂量的照射能促进ATII异常增生和MMPs的合成,但剂量偏高时抑制MMP2和MMP9的合成与释放,影响对肺泡隔过多IV型胶原的降解作用,易于启动肺组织重建的发生。

目前关于IV型胶原降解对肺纤维化发生的作用仍有争议。

有研究认为,明胶酶降解基底膜IV型胶原容易使ATⅡ与肺泡隔Fb直接接触,产生细胞间的某种信号转导,可促进ATⅡ和Fb进一步活化和增殖[10]。

有研究报道,Fb产生的HGF和角质细胞生长因子是ATⅡ最有效的有丝分裂原[11]。

提示ATⅡ与Fb之间的信息交流在肺纤维化启动中可能具有一定作用。

　　TGFβ1可通过调控Fb的细胞周期促进其增殖,参