临床免疫学补体检测及应用Word文档下载推荐.docx

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　　补体系统旁路激活途径及调节因子中另一些组分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子等；

补体调节成分多以其功能进行命名，如C1抑制物、C4结合蛋白、衰变加速因子等；

　　补体活化后的裂解片段以该成分的符号后面加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；

　　具有酶活性的成分或复合物在其符号上划一横线表示，如、，灭活的补体片段在其符号前面加英文字母i表示，如iC3b等；

　　对补体受体以其结合对象命名，如CLrR、C5Ar、对C3片段受体则用CRl、CR2……CR4表示。

　　二、分类

　　构成补体系统包括30余种活性成分，按其性质和功能可以分为三大类：

1.在体液中参与补体活化级联反应的各种固有成分；

2.以可溶性形式或膜结合形式存在的各种补体调节蛋白；

3.结合补体片段或调节补体生物效应的各种受体。

　　三、理化性质

　　补体的大多数组分都是糖蛋白，且多属于β球蛋白，约占血清球蛋白总量的l0%；

Clq，C8等为γ球蛋白；

Cls，C9为α球蛋白。

　　正常血清中各组分的含量相差较大，C3含量最多，C2最低。

各种属动物间血中补体含量也不相同，豚鼠血清中含有丰富的补体，故实验室多采用豚鼠血作为补体来源。

　　补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，如加热、机械振荡、酸碱、酒精等均可使其失活；

在0℃～10℃下活性只保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性；

加热56℃30min可使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭活或灭能。

第二节　补体系统的活化与调控

　　一、补体系统的活化

　　补体系统的各组分在体液中通常以非活性状态、类似酶原的形式存在，当受到一定因素激活，才表现出生物活性。

补体的激活途径主要有两种，即经典途径和替代途径，此外尚有MBL（甘露糖结合凝集素）途径。

　　经典途径和替代途径两种途径的启动过程不一致，但经典途径的激活可以导致替代途径的活化，反之则不行。

　　补体的其他激活途径即甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径，简称MBL途径。

此途径开始于急性期蛋白与病原体的结合，而不是抗原复合物形成。

　　1.经典途径：

经典途径是以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体C1～C9共11种成分全部参与的激活途径。

除了抗原抗体复合物外，还有许多因子可激活此途径，如非特异性凝集的Ig、细菌脂多糖、一些RNA肿瘤病毒、双链DNA、胰蛋白酶、纤溶酶、尿酸盐结晶、C-反应蛋白等。

经典活化途径可人为地分成识别、活化和膜攻击3个阶段。

　　2.替代途径：

替代途径又称旁路途径。

它与经典途径的不同之处主要是越过C1、C4和C2，直接激活补体C3，然后完成C5～C9的激活过程；

参与此途径的血清成分尚有B、D、P、H、I等因子。

替代途径的激活物主要是细胞壁成分，如内毒素、某些蛋白水解酶、IgG4、IgA聚合物等。

替代途径是通过研究C4缺陷而仍保持补体系统活化的患者而发现的。

　　二、补体活化的调控

　　补体系统被激活后，进行系统有序的级联反应，从而发挥广泛的生物学效应，参与机体的防御功能。

如果补体系统活化失控，可形成过多的膜攻击复合物而产生自身损伤，或过多的炎症介质造成病理效应。

正常机体的补体活化处于严密的调控之下，从而维持机体的自身稳定。

　　1.补体的自身调控：

补体激活过程中生成的某些中间产物非常不稳定，成为补体级联反应的重要自限因素。

此外只有细胞表面形成的抗原抗体复合物才能触发经典途径，而旁路途径的C3转化酶则仅在特定的物质表面才具有稳定性，故正常机体内一般不会发生过强的自发性补体激活反应，补体系统自身调控的作用在于维持机体自身的稳定性；

　　2.调节因子的作用：

体内存在多种可溶性膜结合的补体调节因子，它们以特定方式与不同的补体成分相互作用，使补体的激活与抑制处于精细的平衡状态，调节蛋白的缺失有时是造成某些疾病发生的原因。

　　目前发现的补体调节蛋白有十余种，按其作用特点可分为三类：

l）防止或限制补体在液相中自发激活的抑制剂；

2）抑制或增强补体对底物正常作用的调节剂；

3）保护机体组织、细胞免遭补体破坏作用的抑制剂。

第三节　补体系统的生物活性

　　补体是机体重要的免疫效应系统之一。

补体系统活化可以溶解细胞，在活化过程中产生的中间复合物及某些片段也具有多种多样的生物活性，所以补体系统对机体的作用是多方面的，既可参与机体的防御效应和自身稳定，亦可引起免疫损伤。

　　1.溶细胞作用：

不论何种途径活化，补体系统都能对其粘附的细胞产生溶解作用。

补体的溶细胞反应不仅可以抗菌，也可抵抗其他微生物及寄生虫的感染。

另一方面，补体也常常引起病理性反应，如异型输血时的溶血反应、自身免疫病时细胞损伤等；

　　2.免疫复合物的清除：

补体在活化过程中生成的中间产物，对抗原抗体复合物有很强的亲和力，可共价结合到免疫复合物上，然后通过补体的其他效应对免疫复合物产生抑制或清除作用。

常通过以下几种方式对免疫复合物的清除：

1）吞噬调理作用；

2）免疫粘附作用；

3）免疫复合物抑制作用；

　　3.炎症介质作用：

补体是机体重要的炎症介质之一，可通过过敏毒素作用、趋化作用、激肽样作用等多种途径引起炎症；

　　4.中和与溶解病毒作用：

其机理可能是阻止病毒对易感细胞的吸附和穿入，并可能干扰病毒在细胞中的增殖。

第四节　补体的合成与代谢

　　1.补体编码基因：

补体成分十分复杂，各编码基因分散在不同的染色体上，补体成分的许多蛋白质分子具有同分异构现象，显示其遗传多态性。

几乎所有补体蛋白均为单位点常染色体等显性遗传。

编码人C4、C2、B因子的基因在第6对染色体短臂上，与MHC的基因相邻，命名为Ⅲ类组织相容性基因；

与C3、C4反应的许多调节蛋白的基因被组合在一起，在第一对染色体上形成一个超基因家族，此家族编码的蛋白有：

H因子、C4bp、DRF、CRI、CR2等。

　　2.补体合成的器官及细胞：

尽管一些器官和组织产生不同补体成分，但产生补体的主要器官是肝脏，主要细胞是巨噬细胞。

　　3.补体的代谢平衡：

补体成分在血液中可被蛋白酶直接降解，病理情况下补体的代谢速率反映了补体的激活程度，补体活化后的酶解片段迅速失活，并很快从循环中消除，沉着于细胞表面及组织中被消耗或分解。

如C3在C3转化酶作用下，生成C3a和C3b，C3降解为iC3b，再降解为C3c、C3dg。

最后降解为C3d和C3g。

第五节　补体总活性测定

（一）实验原理

　　补体最主要的活性是溶细胞作用。

特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。

补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。

在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。

如以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血处，对补体量的变化不敏感。

S形曲线在30%～70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。

因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比l00%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验即CH50。

（二）检测试剂

　　绵羊红细胞；

溶血素；

稀释缓冲液。

　　（三）方法评价

　　CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。

方法简便、快速，但敏感性较低。

补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系。

缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降，虽可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应，故实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。

　　（四）临床意义

　　CH50法检测是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。

如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的含量；

严重肝病时血浆蛋白合成能力受损。

营养不良时蛋白合成原料不足，也可以不同程度地引起血清补体水平下降。

　　在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。

疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；

病情稳定后补体水平又反应性增高。

因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。

细菌感染特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。

心肌梗死、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等情况下血清补体水平常升高。

第六节　补体结合试验

　　补体结合试验是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。

早在1906年Wasseramann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。

　　1.补体结合试验原理、类型：

补体结合试验中有5种成分参与反应，分属3个系统：

1）反应系统；

2）补体系统；

3）指示系统。

其中反应系统（抗原与抗体）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统。

　　如先加入反应系统和补体，给其以优先结合补体的机会，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原、抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统（SRBL与相应溶血素），由于反应中无游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。

如待测系统中不存在待检的抗体或（抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。

因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。

　　2.补体结合试验的临床应用：

补体结合试验可应用在以下几个方面：

1）传染病诊断，病原性抗原及相应抗体的检测；

2）其他抗原的检测，如肿瘤相关抗原、血液中的蛋白质鉴定，HLA分型等；

3）自身抗体的检测等。

　　补体结合试验的优点为灵敏度高、特异性强、应用面广、易于普及。

缺点为试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁琐并且要求十分严格，容易出现错误。

第七节　单个补体成分测定

　　在30多种补体成分中，主要检测C3、C4、Clq、B因子和Cl酯镁抑制物。

测定方法分为免疫溶血法及免疫化学法。

　　1.免疫溶血法

　　溶血法主要根据抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后可激活补体的经典途径，导致细胞溶解。

该方法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体，即溶血素。

将两者组合作为指示系统参与反应。

　　试验中有两组补体参与，一组是作为实验反应系统的补体，此类试剂可选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清，如某些人可天然缺乏C2、豚鼠缺C5、家兔缺C6；

也可利用化学试剂人为灭活正常血清中某种成分制备缺乏该成分的补体试剂，加入致敏SRBC（检测经典途径补体成分用）或总红细胞RRBC（检测替代途径补体成分用）指示系统后，此时由于补体级联反应体系中缺乏某种补体成分，不能使补体连续激活，不发生溶血。

　　另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补充，补体成分齐全，级联反应恢复，产生溶血。

溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50%溶血为终点。

　　免疫溶血法无须特异仪器与设备，快速，但敏感性较低，影响因素多。

该法不是检测某补