水稻盐胁迫下m6A甲基化修饰特征及抗胁迫机制研究Word文档下载推荐.docx

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KierzekandKierzek,2003）。

m6A修饰频率在RNA中分布不是特别均匀，这种修饰主要富集在3’UTR和终止密码子TES附近，尤其是CDS序列的3’端和3’UTR前端（Dominissinietal.,2012,2013;

Keetal.,2015;

Meyeretal.,2012;

Schwartzetal.,2013,2014）。

在植物中,大约在40年前，已经有国外的课题组首次在小麦、燕麦、胚芽鞘和玉米的RNA中发现m6A修饰（HauglandandCline,1980;

KennedyandLane,1979;

NicholsandWelder,1981）。

除了3’UTR和TES，部分样本在5’UTR和TSS附近也存在大量m6A修饰富集（Slobodinetal.,2017）。

拟南芥叶绿体和线粒体中带有碱基修饰的转录产物中m6A修饰占到了84%的比例，另外64%和79%的m6A甲基化转录物在叶、花和根之间不同的组织表达方式有所不同,换句话说大部分碱基修饰都是m6A修饰,（Wangetal.,2017）。

1.2m6A修饰在植物发育中生物学作用

m6A修饰被认为在植物胚胎发育中起着关键作用。

m6A甲基化转移酶在胚胎后表达水平降低，包括MTA、MTB、FIP37、Virilizer和HAKAI，导致m6A整体水平显著减少。

这些m6Awriters的表达降低或敲除产生了不同的分化表型，包括毛状枝、缺陷叶萌生、营养枝顶端分生组织过度增殖，最终导致胚胎致死（Bodietal.,2012;

Ruzickaetal.,2017）。

ECT2的敲除增加了毛状体分支，表明ECT2对调节毛状体分支的发育至关重要（Lockhart,2018b;

Scutenaireetal.,2018;

Weietal.,2018）。

ALKBH10b的敲除导致开花延迟，也抑制了营养生长，表明ALKBH10b介导的mRNA去甲基化修饰影响mRNA转录的稳定性继而影响成花转变（Duanetal.,2017）。

某些m6A相关基因在调控愈伤组织中转录因子活性方面起着不可或缺的作用，而其他m6A相关基因则与叶绿体以及类囊体功能相关（Lietal.,2014b）。

此外，N6‐mAMP脱氨酶（MAPDA）将N6‐mAMP分解为IMP，这可能与根系发育有关，因为MAPDA的敲除会导致根系生长速度略有下降（Chenetal.,2018）。

1.3m6A修饰在动植物胁迫反应中作用

越来越多的研究表明m6A也参与调节对各种非生物和生物胁迫的反应。

5′UTR上的m6A修饰以一种不依赖帽子结构的方式来指导eIF3E的结合，以促进哺乳动物mRNA在热应激下的翻译启动机制（Meyeretal.,2015）。

在压力胁迫等条件刺激下，5’UTR和转录起始位点TSS上有大量的m6A修饰（Leeetal.,2015;

MeyerandJaffrey,2017;

Wangetal.,2015b;

Zhouetal.,2015）。

在水稻愈伤组织中，发生m6A修饰的基因及发生修饰的mRNA上的具体区间（如TSS、TES、3’UTR及5’UTR等）具有组织特异性（Lietal.,2014b）。

在植物中，许多研究揭示了m6A对应激反应的动态分子调控机制。

ECT1和ECT2与应激反应蛋白CIPK1能够特异性互作，并在不同外部条件刺激下，将钙信号传递到细胞核中（Oketal.,2005）。

这一由ECT2介导的对植物特异性m6Amotif的识别，允许它在热应激条件下下将mRNA重新定位到应激颗粒（Scutenaireetal.,2018）。

因此，m6A修饰似乎是控制基因表达、植物发育和生理过程的有效植物调控策略。

1.4研究的科学意义

迄今为止，m6A的研究大多集中在人类和其他哺乳动物中，而很少有关于植物m6A的论文。

此外，许多关于人类和其他哺乳动物中的m6A文章得出的结论在植物中受到了挑战。

水稻是我国最重要的粮食作物之一，同时也是一种重要的单子叶模式生物。

6mA修饰作为真核生物重要的表观调控方式，水稻基因组上6mA分布较为均一，腺嘌呤甲基化含量在2‰左右，基因组中20%的基因和14%的TE序列存在6mA修饰，修饰主要富集于基因间区（Zhouetal.,2018）。

随着水稻基因组测序的完成，以及各种水稻的信息数据库不断的充实，结合生物信息学技术的快速发展，均为水稻在m6A修饰方面的研宄奠定基础。

同时水稻是对环境胁迫极为敏感的作物，如高盐、低温和干旱等，在水稻发育的不同时期处于逆境胁迫都会对水稻造成不同程度的损害。

水稻盐胁迫会对水稻产量造成严重的减产，因此通过研宄水稻盐胁迫的响应机制，进一步解析其表观调控机理，对于提高水稻耐盐性具有重要的参考意义。

2、研究方案:

根据本课题的研究内容，拟采取如下研究方案：

2.1实验材料

2.1.1叶片材料与生长条件

本研宄所用的材料为水稻梗稻品种（OryzasativaL.ssp.japonica）日本晴Nipponbare,在光照培养箱（光12h,30℃；

暗12h,25℃），正常生长２周的水稻幼苗取出，剪去根须，分别在正常条件（无盐胁迫）和不同盐胁迫条件下（50mM、100mM、150mM）观察水稻幼苗的表型变化。

取样：

将正常条件和盐胁迫处理条件下的水稻幼苗叶片用剪刀全部剪下收集置于液氮冷冻后-80℃保存。

2.2实验方法

2.2.1LC-MS/MS法检测正常和盐胁迫下水稻叶片mRNA整体

m6A水平

首先使用TRIzol提取完TotalRNA后，然后使用oligodT磁珠对mRNA

进行富集；

使用核酸酶P1（NucleaseP1）将RNA从单链消化成单个碱基。

然后加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，将样本注射入液相色谱仪，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量；

质谱串联分析，单个核糖核苷酸会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根据出峰的保留时间计算m6A的面积。

最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。

2.2.2正常和盐胁迫下水稻叶片MeRIP-seq实验方法

图1.完整的m6A-seq/MeRIP-seq建库实验加分析步骤流程图

如图1所示，第一步先对mRNA进行片段化，接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集，然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。

另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。

最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析，得到m6A甲基化程度较高的区域，也叫做m6Apeak。

2.3生物信息学数据分析

数据分析总流程如图2所示，

2.3.1下机数据评估及预处理

下机后的原始数据首先进行测序的质量评估，分别利用SolexaQA和FastQC两个软件对测序的总体质量进行评估，总体质量较差的样本需要考虑是否重新测序。

为了提高序列比对的准确性，需要对原始数据进行了预处理，主要包括三个方面：

去除序列接头adaptor,去除3’末端低质量碱基，去除低质量reads。

图2数据分析总流程

2.3.2序列比对

使用的参考基因组版本为RGAP（RiceGeneomeAnnotationProject）和7.

使用比对软件BWA和Tophat,分别依附于两种不同的peak鉴定

定方法。

2.3.3基因定量、差异表达及聚类分析

依据RPKM（ReadsPerKilobasePerMillion），即每百万条读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数，进行数据归一化，然后使用Cufflinks进行转录定量。

使用R包DEGseq来检查样本之间的差异表达基因，以定位到每个基因

外显子区的读段数作为输入，采用MARS的方法，计算每个基因的P-value。

将P值<

0.001，且经过测序深度的标准化后，两样本的表达水平的差异倍数在２倍以上的认为是差异表达的基因。

功能相关的基因往往具有相似的表达模式，即在不同发育时期表达水平的变化趋势。

利用一些聚类分析的软件如GeneCluster3.0及Ｒ软件包中的heatmap2.0进行层次聚类、K-Means聚类及PCA聚类等。

2.4特定基因的功能分斩

2.4.1GeneOntology分析

特定基因集（如差异表达基因、特异甲基化基困等）的GO富集分析由

在线数据库分析工具agriGO完成。

agriGO中单个富集分析算法采用超几何分布和Yekutieli多重检验校正FDR的方法将显著富集的GOterm与与非富集的GOterm区分开来FDR<

0.05的term被认为是具有显著性的。

2.4.2特定信号通路分析

利用KEGG数据库中的KAAS工具或Mapman等软件可以进行特定

基因的通路定位，找出显著富集的通路，揭示发育过程中对应的调控机制。

2.4.3m6Apeak的鉴定

我们分别选取MeRIP-PF和exomePeak用于平行检测研究样本中的修饰峰。

2.4.4m6Apeak的定量及差异分析

用甲基化的分子所占该基因总RNA分子的比例来表示甲基化的程度。

具体计算方法为NormalizedreadscountofIPsample/NormalizedreadscountsofInputesample，readscount由文库大小既unique-mapped的reads总数进行标准化。

2.4.5m6Apeak保守序列的捜索与鉴定

对m6A修饰位点富集区域的保守序列的捜索，我们采用了两种denovomotif-finding的软件（Homer和MEME-Chip）。

首先根据peak的enrichmentscore按照从大到小排序，选取score值前10000左右的peak，取其reads覆盖度最高点附近的100bp左右的区域用于motif序列的查找。

3、本项目创新之处

本课题将描绘正常及盐胁迫下的水稻m6A修饰图谱，探究m6A修饰在水稻盐胁迫下发挥的作用机制。

一方面为现有的水稻m6A修饰过程提供更多的数据支持，有助于验证或新发现m6A的修饰机制。

另一方面，首次阐明m6A修饰在水稻盐胁迫中生物学作用，结合分子生物学实验，为水稻的遗传育种提供新的可能。

4、研究计划的总体进度及安排

2020年度，水稻育