脉冲场凝胶电泳Word格式.docx
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3EC缓冲液〔6mol/LTris,pH7.5;
lmol/LNaCl;
0.5%
4ESP缓冲液〔0.5mol/LEDTA,1%十二烷基肌氨酸钠,lmg/mL蛋白酶K.
5溶葡萄球菌素〔5mg/mL0
6RNase（10mg/mL
7胶模〔由常规琼脂糖凝胶制得或购置成品
8苯甲基横酰氟〔PMSF〔17.4mg/mL于乙醇中.
90.5dg/mL滨化乙锭
2.别离、纯化大的DNA片段所需材料
1紫外递质.
210mg/mLtRNA
35mol/LNaCl.
4苯酚/氯仿.
53mol/LNaAc,pH5.2.
695充醇.
3.设备
1TBE缓冲液.
2SeakemHGT琼脂糖.
3WideMini-SubCell凝胶电泳设备.
4变速泵或蠕动泵〔Bio-RedLaboratory.
5IBIFIJI600HV程序性开关设备.
6缓冲液冷却循环器〔Fotodyne,NewBritain,WI或MiniChiller〔Bio-RadLaboratory.
【实验步骤】
1.脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备
为防止大分子DNA在提取过程中断裂,细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂
解,在本实验中,我们使用金黄色葡萄球菌（StapHylococcus
aureus作为例子.
1取100mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4C,5000g离心5min.
2用20mLTEN缓冲液冲洗沉淀,同样条件离心5min.之后用10mLEC缓冲液使细胞悬浮.
3取1.5mL细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖的EC
缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4c凝固,混合前加热
至琼脂糖熔解并冷却至50Co
4对于每一个菌株,需要15〜20个凝胶块,将它们放至含有30〜45^g/mLRNase（50mL的10mg/mL的
RNase的10mLEC
缓冲液中,于37c振摇过夜.
5去掉裂解缓冲液,换为10mLESP缓冲液于50c轻度振摇温育48h.
6将凝胶块放在10mL含有174dg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF的TE缓冲液中,室温温育4h（2h换液一次,以灭活ESP中的蛋白酶K.
7用TE清洗琼脂块6h（2h换液一次,置于TE中4c保存.
2.限制酶消化
提升PFGE的分辨率取决于100〜1000kb片段电泳结果的重复率,它与酶切关系密切,可在琼脂糖凝胶块中使用适宜的内切酶消化.（生物秀实验频道
125dL10X反响缓冲液,30U限制酶,加双蒸水至250dL混匀.
2取一个凝胶块置其中,适宜温度下温育过夜（按内切酶要求后,用TE缓
冲液洗涤并贮存.
3.应用PFGE对样品DNA进行分析
1用0.5XTBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHG哧脂糖凝胶,胶的厚度尽量与样品凝胶块相符.假设用WideMinisubCell
进行电泳的话,50mL该溶液即可.
2胶凝后,小心移去样品梳.将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小,将样心地插入加样孔,防止产生气泡.〔假设样品在溶液中,以l:
1
的比率与50c2%Seaplaque琼脂糖相混合,迅速注入加样孔中.
3把胶放入电泳槽内,加缓冲液,刚好覆盖胶的外表即可,缓冲液事先14c
冷却.
4将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连.翻开电源,调节蠕动泵到适当流速〔5〜10mL/rain或翻开变速泵至40.
5通过计算机启动极性转换程序.大于50kb的限制性片段在1.2s和0.4s
正向和反向的电脉冲下得以别离,时间一般为3.5h或更长.小于50kb
的限制性片段在0.4s正向和0.2s反向的电脉冲〔比率为2:
1下得以别离,时间为3〜5h0
6在0.5dg/mL滨化乙锭中进行染色并拍照.
4.别离、纯化大的DNA片段
1凝胶染色、分析后,在目的带前〔靠近正极处切一个0.25cm2左右的槽,注入0.8%Seaplaque琼脂糖,使之凝固.
2重新翻开极性转换开关,用紫外递质检测DNA的迁移,当目的带进入
Seaplaque凝胶中时,关闭开关,切下目的带,移至1.5mLEP管中.
3参加2dL的tRNA,30dL5mol/LNaCl,370dL蒸储水,在65〜70c之间,化胶并保
温10min
4苯酚/氯仿500dL抽提两次.
5用2.5倍体积95充醇和1/10体积NaAc〔3mol/L,pH5.2于-70C10min沉淀水相.再用70充醇洗两次并将沉淀溶于TE
缓冲液中.
【考前须知】
1.换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶.
2.PMSF是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂,即有毒又挥发,操作时应在通风橱中进行.
3.用蛋白酶K包埋的材料时50c温育时间很长〔24〜48h,有些学者提出如此长时间不必要〔Mortimeret
al.1990,且可能造成高分子质量DNA降解.在实验中可视情况而定.
4.琼脂糖凝胶块在TE〔pH7.6中4c可存放数年,如在0.5mol/LEDTA中可存放更长时间.
5.一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳,由于这些电源设计时均带有保护电路,它可以检测到负载的忽然降低并且引发外加电源自动关闭.
6.由于电压较高,就会产生热量,为了保证温度为14C,需要一些冷却设
备〔缓冲液冷却循环器或MiniChiller.止匕外,把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温.
PFGE〔脉冲场凝胶电泳〕标准操作规程〔SOP
目的：
运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型
背景知识：
这个试验是公认的操作繁琐,至少要2天,而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响,因此,一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的.
主体内容：
一、胶块的制备
1、在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照,分别参加约2ml细胞悬浊液（CSB;
2、在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、在模具上标记好对应样品的名称；
4、用CSB湿润接种环,从培养皿上刮取适量细菌,均匀悬浊于CSB中,
用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值,并调整至3.6~4.5.如果
OD值大于4.5,参加CSB稀释；
如果OD值小于3.6,增加菌量提升其浓度.
5、取400dl细菌悬浊液于相应的1.5mleppendorf管中,置于37c水浴中孵
育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中.
6、从水浴箱中取出eppendorf管,每管参加20dl蛋白酶K（储存液浓度为
20mg/ml混匀,使其终浓度为0.5mg/ml.
7、制备好1%SeakemGold1%SDS放于56c水浴箱中.
8、在eppendorf管中参加400dl的1%SeakemGold:
1%SDS用枪头轻轻混匀.
9、将混合物参加模具,防止气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.
考前须知：
（1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中.
（2细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上
（3在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold:
1%SDSf要防止气泡的产生.
（4混合物参加模具时不能产生气泡.
（5在加1%SeakemGold:
1%SDS勺过程中1%SeakemGold:
1%SDS?
一直放在56c水浴箱中.
二、细胞的裂解
1、在50ml的screw-captube上做好标记.
2、配制细胞裂解液（CLB:
每5ml细胞裂解液参加25dl蛋白酶K（20mg/ml,使其终浓度为0.1mg/ml,然后颠倒混匀.
注意：
蛋白酶K要置于冰上,配制好的细胞CLB也要置于冰上.
3、每个管子参加5ml蛋白酶K/CLB混合液.
4、如果想使胶块平齐,可以用刀片削去模具外表多余的局部.
（1可重复利用的模具：
翻开模具,用小铲的宽头局部将胶块移入相应的screw-cap管中.
（2一次性模具：
撕掉模具下面的胶带,用小铲将胶块捅进相应的screw-cap
管中,将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中.
5、保证胶块在液面下而不在管壁上.
6、将管子放在54c水浴摇床中孵育2小时,转速约170转/分钟.
7、将纯水和TE放在50c水浴摇床中预热.
三、洗胶块
1、从水浴摇床中拿出screw-cap管,盖上绿色的screened-cap.轻轻倒
CLB0在实验台上轻磕管底使胶块落在管底.
注意:
把管倒置在吸水纸上,使管内液体被尽量排除干净.随后的操作中也如此.
2、每管中参加15ml预热的纯水.
10分
3、保证胶块在液面下而不在管壁或盖子上,放回50c水浴摇床中,摇
4、倒掉水,用纯水再洗一次.、
5、倒掉水,参加15ml预热的TE,在50c的水浴摇床中摇15分钟.
6、倒掉TE,用TE重复洗三次,每次10—15分钟.
7、倒掉TE,参加10mlTE,放在4c冰箱保存备用.
要保证胶块在液面下而不在管壁或盖子上.
四、胶块内DNA的酶切
1、在1.5mleppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称.
2、根据下面的比例配制缓冲液H的稀释液,混匀.
试剂dl/胶块dl/10胶块
纯水180dl1800d1
BufferD20dl200d1
总体积200dl2000d1
缓冲液要置于冰上.
3、在每个1.5mleppendorf管中参加200dl缓冲液H的稀释液.
4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上.
5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中.保证胶块在液面下面.将剩余的胶块放回原来的TE中.
6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块.
7、将管子放在37c水浴中孵育10-15分钟.
8、在用稀释缓冲液孵育的过程中,根据以下的比例配制酶切缓冲液,混匀.
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