组织培养实验指导书Word文件下载.docx
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3、每人清洗部分玻璃器皿
清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。
对于较脏玻璃器皿的洗涤：
采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液（一种强氧化剂，去污能力强，配制方法：
重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸），浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。
对于带有石蜡或胶布的器皿：
先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。
（二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌
1、玻璃器皿和用具的灭菌
（1）采用干热灭菌法：
将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。
当温度升至150℃时，定时控制40min（或120℃定时120min）,达到灭菌目的。
（2）采用高压蒸汽灭菌法：
即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15～20分钟。
有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。
（3）灼烧灭菌：
用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。
操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。
2、环境的消毒
（1）地面、墙壁和工作台的灭菌
每次使用前，将配好的20%新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。
在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。
然后开启紫外灯开关，照射15～30min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。
（2）无菌室和培养室的灭菌
消毒灭菌的方法：
首先将房子关闭，定期用甲醛和高锰酸钾2：
1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。
操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾，封闭消毒期间不宜进入消毒空间。
三、实验报告
1．将本次实验内容整理成实验报告。
2.试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？
实验二培养基母液的配制与保存（MS培养基）
通过学习MS培养基母液的配制与保存，掌握培养基母液浓度的换算、配制与母液的保存方法。
培养基制备之前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当制备培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
三、实验仪器、用具及试剂
（一）实验仪器、器皿及用具
电子天平（感量为0.0001g、0.01g）,烧杯（1000ml，100ml，50ml）、量筒（1000ml，100ml，50ml）、容量瓶（1000ml，500ml，200ml，100ml，50ml）、棕色或白色广口瓶（1000ml，500ml，200ml，100ml）、药匙、玻璃棒、称量纸、标签、冰箱。
（二）试剂
MS培养基所需各种试剂、IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸馏水、重蒸馏水。
四、实验步骤与方法
母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。
配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。
配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。
现以MS培养基（Murashige和Skoog,1962）为例叙述如下：
（一）、大量元素母液（浓缩10倍）的配制
MS培养基配方中大量元素共有5种（表1-1），按照培养基配方的用量，各种化合物扩大10倍，用电子天平分别称好，分别用50ml烧杯称量，加30-40ml蒸馏水溶解。
5种化合物分别充分溶解后，按顺序混合定容在1000ml量筒中，注意在混合定容时，一定要最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢钾形成磷酸三钙，磷酸钙之类是不溶于水的沉淀（也可将钙盐与镁盐单独配成母液存放），将配好的定容溶液倒入1000ml广口瓶中，贴好标签保存于冰箱的冷藏室中。
配置培养基时，每配1L培养基取此母液100ml。
表1-1Murashige和Skoog大量元素的称量及定容
化合物名称
培养基配方用量（mg/L）
扩大10倍称量（mg）用于定容
KNO3
1900
19000
NH4NO3
1650
16500
MgSO4·
7H2O（无水MgSO4）
370（190）
3700（1900）
KH2PO4
170
1700
CaCl2·
2H2O（无水CaCl2）
440（330）
4400（3300）
（二）、微量元素母液（浓缩100倍）的配制
MS培养基配方中微量元素共有7种（表1-2），按表中称取用量，用感量为0.0001g电子天平，分别称取后，均放入1000ml的一个烧杯中，加蒸馏水溶解，然后定容到1L容量瓶。
贴好标签，放入冰箱保存。
配置培养基时，每配制1L培养基取此母液10ml。
表1-2微量元素母液各化合物用量
扩大100倍称量（mg）用于定容
MnSO4·
4H2O（MnSO4·
H2O）
22.3（16.9）
2230（1690）
ZnSO4·
7H2O
8.6
860
CuSO4·
5H2O
0.025
2.5
H3BO3
6.2
620
Na2MoO4·
2H2O
0.25
25
KI
0.83
83
CoCl2·
6H2O
（三）、铁盐母液（浓缩200倍）的配制
目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。
这种螯合物使用起来方便，比较稳定，又不易发生沉淀。
配制方法是：
用感量为0.01g的电子天平称取硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解在200ml蒸馏水中，两种溶液混合定容至500ml，用棕色广口瓶盛装，贴标签，放入冰箱保存。
注意：
两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。
配置培养基时，每配制1L培养基取此母液5ml。
（四）、有机物母液（浓缩100倍）的配制
在MS培养基中，有机物配方成份有维生素和氨基酸（表1-3）。
按表1-3中的用量用电子天平进行称量，分别溶解，混合定容至100ml。
贴标签，放入冰箱保存。
表1-3有机物母液的称量
扩大100倍称量（mg）
VB1（硫胺素）
0.4
4.0
VB5（盐酸吡哆醇）
0.5
5.0（NaOH溶解）
VB6（烟酸）
肌醇
100
1000
甘氨酸
2
20
（五）、生长调节物质（激素）母液的配制（浓度1mg/ml）
激素的使用比较灵活，要根据培养的植物种类和目的而定。
为了操作方便，节约时间，激素也可如同配制上述母液一样，先配成浓缩母液（1mg/ml），这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
生长调节物质一般不溶于水，可先用少量不同的溶剂来溶解。
例如，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（Ze）可先用少量95%酒精助溶，然后再加蒸馏水定容至刻度。
激动素（KT）和6-苄基嘌呤（6-BA）可先溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解（见附表2）。
用电子天平分别称量各种生长调节物质50mg，并先用相应的少量有机溶剂进行助溶，再加蒸馏水定容至50ml，可得到浓度为1mg/ml的生长调节物质母液,即配制的母液每毫升含有生长调节物质1.0mg。
贴好标签，写明配制的激素浓度，存于冰箱保存（0~4℃）。
配制培养基时，如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取0.5ml母液即可。
各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，使用中防止污染和沉淀（贮存温度过低时会产生针状结晶），发现有沉淀或霉团时，则不能继续使用。
五、实验报告
1、将本次实验内容整理成实验报告。
2、制备母液时应注意哪些问题？
为什么？
3、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、PH值，按MS配方计算各种母液吸取量，填入下表：
表1-5按MS配方需要量和母液浓度计算各种母液吸取量并填入下表
药品名称
MS配方需要量
母液浓度
配制培养基母液吸取量/ml
1000ml
500ml
300ml
大量元素
10倍液
微量元素
1000倍液
铁盐
5ml/L
0.4mg/L
1mg/L
0.5mg/L
2mg/L
100mg/L
20mg/L
2，4-D
KT
蔗糖
20g/L
琼脂
8g/L
PH值
5.8
实验三MS固体培养基的配制及灭菌
通过MS培养基的配制，学习培养基配制与灭菌的操作方法。
植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择一个符合实验材料需要的适宜培养基。
大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物质、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。
（一）实验仪器、器皿及用具
移液管（枪）、量筒（5
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