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气相色谱分析

第五章分子发光分析法

基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光（MolecularLuminescence）。

依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。

光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。

本章讨论分子荧光（MolecularFluorescence）、分子磷光（MolecularPhosphorescence）和化学发光（Chemiluminescence）分析法。

第一节荧光分析法

一、概述

分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。

早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。

这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。

到1852年才由斯托克斯（Stokes）给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。

斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。

1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。

进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。

荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。

虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。

使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。

二、基本原理

（一）分子荧光的产生

大多数分子含有偶数电子。

根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态（2S+1=1），基态单重态以S0表示。

当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。

处于电子激发态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁释放能量而返回基态。

辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧光和分子磷光；无辐射跃迁则以热的形式释放能量，包括振动弛豫（VR）、内转化（ic）和体系间窜跃（isc）等。

图5-1为分子内所发生的各种光物理过程的示意图。

图5-01分子内的光物理过程.doc图5-01分子内的光物理过程.JPG

图5-1分子内的光物理过程A1,A2-吸收F-荧光P-磷光ic-内转化isc-体系间窜跃VR-振动弛豫

振动弛豫是在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。

振动弛豫过程的速率极大，在10-14～10-12s内即可完成。

内转化是相同多重态的两个电子态之间（如S2→S1,S1→S0）的非辐射跃迁。

内转化过程的速率在很大程度上决定于相关能级之间的能量差。

相邻单重激发态之间能级较近，其振动能级常发生重叠，内转化很快。

因此，通常不论分子被激发到哪一个电子激发态，在10-13～10-11s内经内转化和振动弛豫都会跃迁到最低电子激发态的最低振动能级上。

基态（S0）和第一电子激发单重态（S1）之间的能量差较大，因而S1→S0内转化的速率相对要小得多，使得第一电子激发态有相对较长的寿命。

处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时，就产生了分子荧光。

由于激发态中存在有振动弛豫和内转化现象。

使得荧光的光子能量比其分子受激发所吸收的光子能量低。

因此，荧光波长λ3总比激发波长λ1或λ2要长。

而且，不论电子开始被激发至哪个能级，都将只发射波长为λ3的荧光。

荧光的产生在10-9～10-6s内完成。

体系间窜跃是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。

当分子的第一、二电子处于激发三重态（2S+1=3）时，以Tl、T2表示。

单重激发态Sl的最低振动能级同三重态T1的较高振动能级重叠。

因而S1→T1的体系间窜跃就有了较大的可能性。

第一电子激发单重态的分子经体系间窜跃到达三重态后，快速振动弛豫至最低振动能级v=0上。

此时有两种途径返回基态，一是辐射跃迁发出磷光，二是体系间窜跃。

由于改变电子自旋的跃迁属禁阻跃迁，因而跃迁速率小得多，使得三重态有较长的寿命，约为10-3～10s

（二）荧光效率及其影响因素

1．荧光效率物质在吸收了紫外和可见光后，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁回到基态，决定了物质是否能发荧光。

通常以荧光效率（或荧光量子产率）来描述辐射跃迁概率的大小。

荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值，即

（5—1）

荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强，若以各种跃迁的速率常数来表示，则

（5—2）

式中：

Kf为荧光发射过程的速率常数，∑Ki为非辐射跃迁的速率常数之和。

一般来说，Kf主要取决于物质的化学结构。

而∑Ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。

具有分析应用价值的荧光化合物，其荧光效率在0.1～1之间。

2．荧光与分子结构的关系首先，物质只有能够吸收紫外—可见光。

才有可能发荧光。

因此，发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大，π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。

大部分能发荧光的物质都含有一个以上的芳环，随共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波长方向移动。

如萘的荧光效率为0.29，荧光波长为310nm，而蒽的荧光效率为0.46，荧光波长为400nm。

其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。

以荧光黄和酚酞为例，二者结构十分相似，但荧光黄在0.1mol·L-1NaOH溶液中的荧光效率高达0.92。

而酚酞由于没有氧桥，分子不易保持刚性平面，不易产生荧光。

刚性平面结构可以减少分子的振动相碰撞去活的可能性。

一些有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光大大增强，这也可用刚性结构的影响来解释。

例如，8—羟基喹啉本身荧光较弱，与Mg2+形成螯合物后则是强荧光化合物。

再如，滂铬BBR本身不发荧光，与Al3+在pH＝4.5时形成的螯合物发红色荧光。

Al3+-滂铬BBR螯合物.JPG

取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。

给电子取代基如―OH、―NH2、―NR2和―OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子取代基如―COOH、―NO和―NO2等使荧光减弱，例如，苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯为非荧光物质。

随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强。

这种所谓的“重原子效应”是由于重原子中能级交叉现象严重，容易发生自旋轨道偶合作用，使S1→T1的体系间窜跃显著增加所致。

3．环境因素对荧光的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。

一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。

溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。

例如，奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。

温度对于溶液荧光强度的影响非常显著。

通常认为，辐射跃迁的速率基本不随温度而变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著地增大。

因此，对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。

由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光影响比荧光更大。

大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。

共轭酸碱两种型体具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种型体，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长，例如：

不同共轭体系的荧光.JPG不同共轭体系的荧光.doc

溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。

由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。

其它顺磁性物质也有这种作用。

（三）荧光强度与溶液浓度的关系

根据荧光效率的定义，荧光强度If应为所吸收的辐射强度Ia与荧光效率φf的乘积：

If=φfIa=φf（I0-I）

由于I=I0·10-A

可得If=φfI0（1-10-A）

（5―3）

如果溶液很稀，吸光度A<0.05，方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则上式可简化为

If=2.3φfI0A=2.3φfI0kbc（5—4）

可见，当A<0.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系数和溶液的浓度成正比。

对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关：

If=Kc（5―5）

上式为荧光定量分析的基本依据。

以荧光强度对荧光物质的浓度作图，在低浓度时，呈现良好的线性关系。

当荧光物质的溶液浓度较高时，荧光强度同浓度之间的线性关系将发生偏离，有时甚至随溶液浓度增大而降低（图5-02荧光强度与溶液浓度的关系.JPG图5-2）。

导致标准曲线弯曲的原因，除了式（5-3）中的高次项影响外，还存在猝灭效应。

荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。

与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质、称为荧光猝灭剂。

前面提到的氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。

由荧光物质自身引起的荧光强度减弱的现象称为荧光自猝灭效应。

经常遇到的自猝灭现象有两种。

一种是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。

另一种是由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。

很显然，不论哪种情况，增大荧光物质的浓度均会使荧光猝灭效应增强，从而导致标准曲线向浓度轴弯曲，即使荧光强度降低。

（四）荧光的激发光谱和发射光谱

以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强的波长处测量荧光强度，以激发波长为横坐标。

荧光强度为纵坐标绘制关系曲线，便得到荧光激发光谱。

激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。

若固定激发光的波长和强度不变，测量不同波长下的荧光强度，绘制荧光强度随波长变化的关系曲线，使得到荧光发射光谱，简称荧光光谱。

激发光谱和荧光光谱是荧光测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用于鉴别荧光物质。

三、荧光分析仪器

常用的荧光分析仪器也是由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。

它与分光光度计比较主要差别有两点。

第一，荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光（图5-03荧光分析仪器示意图.doc图5-03荧光分析仪器示意图.JPG如图5-3所示），以消除透射光的影响。

第二，荧光分析仪器有两个单色器，一个是激发单色器，置于液槽前，用于获得单色性较好的激发光；另一个是发射单色器，置于液槽和检测器之间，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。

（一）光源

荧光测量中的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度。

在荧光计中，常使用卤钨灯作光源；在荧光分光光度计中，通常采用高压汞灯或氙弧灯作光源。

高压汞灯是利用汞蒸气放电发光的光源，其光谱略呈带状，以365nm的谱线为最强。

荧光分析中常使用365nm、405nm和436nm三条谱线。

高压氙弧灯是荧光分光光度计中应用虽广泛的一种光源。

氙灯是一种短弧气体放电灯，工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强电子流（电弧），氙原子与电子流相撞而解离为正离子，氙正离子与电子复合而发光，其光谱在250～800nm范围内呈连续光谱。

此外，作为一种新型荧光激发光谱，可调谐染料激发器显示出了巨大的优势。

（二）单色器

荧光计的单色器是滤光片，因而荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。

荧光分光光度汁一般采用两个光栅单色器。

荧光分光光度计既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。

（三）检测器

荧光的强度一般较弱，要求检测器具