蛋白质的十种提取方法Word格式.docx

蛋白质的十种提取方法Word格式.docx

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3、用离心机离心8000rpm40min4?

或11100rpm20min4?

4、提取上清夜，样品制备完成。

蛋白质提取液:

300ml

1、1Mtris-HCl（PH8）45ml

2、甘油（Glycerol）75ml

3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳～

二、

植物组织蛋白质提取方法（summer）

三氯醋酸—丙酮沉淀法

1、在液氮中研磨叶片

2、加入样品体积3倍的提取液在-20?

的条件下过夜，然后离心（4?

8000rpm以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4?

8000rpm以上1小时），然后真空

干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15?

8000rpm以上1小

时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4?

待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80?

备用。

药品:

提取液:

含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮

裂解液:

2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的

DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点～当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少～

三、

组织:

肠黏膜（newinbio）

目的:

WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达

应用TRIPURE提取蛋白质步骤:

含蛋白质上清液中加入异丙醇:

（1.5ml每1mlTRIPURE用量）

倒转混匀，置室温10min

离心:

12000g，10min，4度，弃上清

加入0.3M盐酸胍/95,乙醇:

（2ml每1mlTRIPURE用量）

振荡，置室温20min

7500g，5min，4度，弃上清

重复0.3M盐酸胍/95,乙醇步2次

沉淀中加入100,乙醇2ml

充分振荡混匀，置室温20min

7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

1,SDS溶解沉淀

10000g，10min，4度

取上清-20度保存（或可直接用于WESTERNBLOT）

存在的问题:

加入1,SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶,测

浓度，含量才1mg/ml左右。

解决:

提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5,10分钟，效果很好的。

四、

lysissolution:

（yog）

Proteinextractionbuffer（Camiolobuffer）:

100ml=（0.075MPotassiumAcetate）0.736g（0.3M）NaCl1.753g

（0.1M）L-argininebasicsalt1.742g（0.01M）EDTA-HCl0.292g

（0.25%）TritonX-100250.ul

upto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.

1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.

3.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.

4.Homogenizefor1minuteat4\'

C.5.Spinat3,000.rpm/15minutes/4\'

C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith

50mM/LTris-HClpH7.4.

五、

植物材料:

水稻苗，叶鞘，根（ynibcas）

1、200毫克样品置于冰上磨碎

2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

3、重复离心5min

lysisbuffer:

ureanp-40ampholine2-mepvp-40

六、

蛋白质样品制备（sigma）

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。

100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入

1.5ml10%三

氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20?

沉淀1小时，4?

，15000

r/min离心15

min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10mMβ-巯基乙醇），再于-20?

沉淀1小时，同

上离心弃上清，

（有必要再用80,丙酮（含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二

硫苏糖醇），

2%Ampholine（AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10），6%TritonX-100]，37?

温

育30min，期间搅

动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力

越大时间长一点

越好～上清即可上样电泳。

或者-70度保存

七、

植物根中蛋白质的抽取（phenol）

（1）sample,液氮研磨

（2）装1.5mlcentrifuge用tube

（3）加1MKH2PO4+K2HPO4700ul

（4）12000rpm,4度,10-15minite

（5）取上层液，蛋白质就在里面

八、

SDSextractionfollowedbyacetoneprecipitation–simpleextractionprotocolthatdoesnotrequirephenol.

Recommendedstartprotocolforwholetissueextractions.（hgp）

1.Grind1goffreshtissuetoapowderwithliquidnitrogeninamortarandpestle.

2.Add5mLofextractionmedia（0.175MTris-HCl,pH8.8,5%SDS,15%glycerol,0.3

MDTT）directlyto

mortarandcontinuegrindingforanadditional30sec.3.Filterhomogenatethroughtwolayersofmiraclothintoa50mLFalcontubeatroom

temperature.

4.Immediatelyadd4volumesoficecold100%acetonetofilteredhomogenate,mix

byvortexingandplaceat-20

Cforatleastonehourtoprecipitateproteins.5.Centrifugeat5000gfor15mintocollectprecipitatedprotein,decant

supernatant.

6.GentlyblotresidualacetonefromcontainerwithKimwipeandthenwashpelletin

15-20mLofcold80%

acetone.Besuretothoroughlybreak-uppelletbypipetting,vortexingorsonication.7.Repeatsteps5and6.

8.Collectfinalproteinprecipitatebycentrifugationat5000gfor15minanddrypelletbyinvertingonKimwipe

for15minat37C.

9.Resuspendfinalpelletin0.5-1mLofIEFextractionsolution（8Murea,2Mthiourea,2%CHAPS,2%Triton

X-100,50mMDTT,0.2%pH3-10ampholytes）bypipettingandvortexingat25-30C.Incubatesamplefor1hat

roomtemperaturewithagitation.Donotheatsampleunderanycircumstancesasthiswillleadtocarbamylationof

proteins.

10.Centrifugefor10minat12000gandusesupernatanttorehydrateIPGstrips.11.Ifproteinquantitationisnecessary,precipitateproteinsamplewithTCAoracetonepriortoperforming

BradfordorLowryassayasdetergentsandreducingagentsinterferewiththeseassays.Phenolextractionfollowedbymethanolicammoniumacetateprecipitation–an

effectiveprotocolforsample

preparationfromprotein-poor,recalcitranttissuessuchasplants（seeHurkmanand

Tanaka,1986,Plant

Physiology81:

802-80

九、

材料:

细菌蛋白（puc18）

用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。