RT-PCR实验报告文档格式.doc

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实时pcr（real-timepcr），属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。

realtimepcr的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在dsdna中插入特异的萤光色素；

另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

realtimepcr与reversetranscriptionpcr相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种rtpcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitativert-pcr）”

rt-pcr技术相关试剂

oligo:

多聚体，相当于mrna引物

amv（m-mlv）：

逆转录酶

dntp：

脱氧核苷酸

rnase：

rna酶抑制剂

pcrbuffer：

rt-pcr缓冲液

mgcl2：

2价镁离子

pcr各步骤的目的

（一）预变性：

破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。

使dna充分变性，减少dna复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要吝

啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr反应得以顺利进行。

（二）变性--退火--延伸循环：

①模板dna的变性：

模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板dna与引物的退火（复性）：

模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链。

（三）pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟

用pcr仪扩增时,（变性.退火,延伸）循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：

1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将

延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：

在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用，可以直接用于ta克隆的进行。

什么是半定量pcr

半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitativereversetranscriptionandpolymerasechainreaction,sqrt-pcr）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中特异mrna的相对数量。

以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标化的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。

这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。

步骤：

1.抽提rna，2.反转录获得cdna，3.以cdna为模板做pcr注意：

步骤1，

rna抽提质量一定要好，注意污染。

内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。

步骤3，半定量rt-pcr应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！

指数期和平台期一定要摸清楚！

半定量rt-pcr与荧光定量real-timepcr最大的区别就在于semi-pcr需要跑电泳根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-timepcr则无需电泳可以实时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standardcurve来判断gene拷贝数的高低。

所以由上可见semi-pcr不如real-timepcr精确。

至于rt应该指reversetranscription。

为了便于区分我们更偏好使用qpcr来特指real-timepcr

同时要注意realtime-pcr的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。

所以要利用meltingcurve，如果是第一次做一个目的基因的realtime-pcr，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。

rt-pcr只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。

而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。

所以，

realitime-pcr更精确些。

篇二：

rt-pcr实验方法

逆转录pcr（rt-pcr）

实验四逆转录pcr（rt-pcr）

【实验目的】1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。

【实验原理】聚合酶链式反应（pcr）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。

因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增实验四逆转录pcr（rt-pcr）

【实验目的】

1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。

【实验原理】

rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。

rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。

rt-pcr的基本原理（图4.1）。

首先是在逆转录酶的作用下从rna合成cdna，即总rna中的mrna在体外被反向转录合成dna拷贝，因拷贝dna的核苷酸序列完全互补于模板mrna，称之为互补dna（cdna）；

然后再利用dna聚合酶，以cdna第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dntp）为材料，在引物的引导下复制出大量的cdna或目的片段。

在rt时，有3种引物可选择（表4.1）。

用1）和2）方法，

理论上是扩增的所有的cdna，还要用此产物做pcr的模板继续扩增。

如果用3）方法，先要去/retype/zoom/7b17bdaf89eb172ded63b7a3?

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由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。

引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。

这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。

为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。

随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。

因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一般选用poly（a）+rna。

oligo（dt）起始比随机引物特异性高。

它同大多数真核细胞mrna3端所发现的poly（a）尾杂交。

因为poly（a）+rna大概占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cdna的数量和复杂度要少得多。

因为其较高的特异性，oligo（dt）一般不需要对rna和引物的比例及poly（a）+选择进行优化。

建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo（dt）。

oligo（dt）12-18适用于多数rt-pcr。

基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。

gsp是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo（dt）那样同所有rna退火。

用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。

gsp可以同与mrna3最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

已经制备好的双链cdna和一般dna一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需

有适当的接头（linker），接头可以是在pcr引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经pcr扩增后再克隆入相应的载体；

也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna的末端接上一段寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。

本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因，fas配体（fasl）是一分子量约为40u的ii型跨膜糖蛋白，属tnf家族成员。

活化的t细胞可表达fas和fasl，并通过fas/fasl系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。

近年研究发现在部分癌细胞中fasl表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。

我们采用rt-pcr方法克隆fasl全长cdna并构建其表达载体，可以为进一步研究fasl的功能提供条件。

在上下游引物的5’端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基（即hindiii和bamhi），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pgfpuv上（附录图4.3）。

为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pgfpuv，在其上加了6×

his标签。

【试剂与器材】

（一）试剂

1.总rna（或mrna）

2.rna酶抑制蛋白（rnaseinhibitor）：

40u/ml

3.dntp混合物（各10mm）

4.oligo（dt）12-18：

2.5?

mol/l

5.10*逆转录合成缓冲液（10?

rtbuffer）：

250mmol/ltris-hcl（ph8.3），375mmol/lkcl，15mmol/lmgcl2

6.amv逆转录酶5u/?

l

7.基因特异性5’和3’引物各20?

8.tapdna聚合酶5u/?

9