第2章 DNA的复制优质PPT.ppt

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基因的自我复制基因的自我复制基因的突变基因的突变控制性状的表达控制性状的表达DNA复制复制亲代双链亲代双链DNA分子在分子在DNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以每单链每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNA分子完分子完全相同的子代全相同的子代DNA分子的过程。

分子的过程。

Replicon;

Replisome;

AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminatorThemultiprotein（30）structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA复制机理的复杂性复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求能量的供求构型的变化构型的变化超螺旋超螺旋线状，开环状线状，开环状多种酶类的互作多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制起始控制机理知之甚少复制的准确性复制的准确性（修复，校正）（修复，校正）研究试材的特殊性研究试材的特殊性（温度敏感型（温度敏感型ts，突变抑制体系突变抑制体系Su）DNA复制速度复制速度（E.coli105bp/min，高速解旋高速解旋112km/h?

）缺乏统一的模式缺乏统一的模式（D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA.）3.2.复制起点与方向复制起点与方向（replicationorigin&

direction）isolationoforiC复制起点的特征复制起点的特征J.W.Zyskind克隆到克隆到E.colioriC确定其最小区段为确定其最小区段为245bp，并与沙门氏菌等并与沙门氏菌等4钟细菌的钟细菌的oriC序列进行比较分析发现序列进行比较分析发现；

245bpminimaloriginofreplicationrichAT&

DNApolymerase（DnaA）bindingsiteoriCoriCRNApol发动发动primer真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的ATrich“呼吸呼吸现象现象”DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条导致两条DNA链链不断解链与聚合，不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。

形成瞬间的单泡状结构的过程。

在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显replicationorigin两侧基因的转导频率高两侧基因的转导频率高4a4b3c3d2e2f1g1haobcaobdecaobdfgecaobdfh复制的不同步性复制的不同步性断裂的随机性断裂的随机性MostrDNAarelocatedneartheoriginofreplication复制的多模式复制的多模式单单起点、起点、单单方向方向多多起点、起点、单单方向方向单单起点、起点、双双方向方向多多起点、起点、双双方向方向1963Cairns37,5ci/mMH3-T,6min37,52ci/mMH3-T,6min42,T,onecircle复制多模式的证据复制多模式的证据模式？

模式？

E.colithy-slow-stopmut.ts复制发动温度敏感突变型复制发动温度敏感突变型42不能发动不能发动DNA复制、但可完成复制、但可完成DNA延伸延伸慢停慢停突变突变（slow-stopmutation）当温度升高，复制停止当温度升高，复制停止在下一周期开始在下一周期开始快停突变快停突变（fast-stopmutation）当温度升高，复制立即停止当温度升高，复制立即停止单单起起点、点、双双方方向向R.L.RodriguezE.colithy-slow-stopmut.ts4237,5ci/mMH3-T,20min37,52ci/mMH3-T,45min子链子链DNA延伸方向延伸方向DNApolymerasereactsonthe3endonlyOHTCATCACOH3NewDNAelongationfrom5to3directionpppOHC+ppi进化中保留进化中保留的深刻的、的深刻的、选择与适应选择与适应的、化学及的、化学及功能的根源功能的根源5PPP5PPP如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是35ATCG+5pppOH3GpppOHGATCG5pppOH3ATCG+5pppOH3GpppOHG5ppp因能量的需要，因能量的需要，DNA的的5端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有ppppppOH3ATCG在在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5端，而且端，而且双链双链DNA的的5端碱基配对困难端碱基配对困难需要其他机制以解脱需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正碱基发生错配后的校正费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.3.DNA的半保留复制的半保留复制（Semi-ConservationReplication）Threereplicationhypotheses（CsClgradientcentrifuge）N15N14DNASemi-ConservationReplicationM.MeselsonandF.W.Stahl,Sciences44:

675,1958.3535OK!

How?

5353a）Okazakifragment1968ReijiOkazakiE.colit-2,7,15,60pulse-labelingindT-H3stopinKCN0D.S.DNAS.S.DNADensitygradientofsucroseMeasureH3-Tpulse-chase20indT-H330transfertodTthencontinueH3-Tpulse-chasepulse-labeling12060157210S（1kb）40S（Prok.400Nt/sec）DNAreplicationinOkazakifragment1kb5353DNAreplicationinOkazakifragment1kb5353（semi-discontinuousreplication!

）？

b）半不连续复制半不连续复制c）（semi-discontinuousreplication）证据证据dumpfragmentinDNAdUTP:

dTTP=1：

300incell-A-T-G-C-AUGUdutgenedUTPase少数少数dUTPDNA中不能有中不能有U?

-A-T-突变频率=1/1200！

？

-A-A-U-UngaseungU尿嘧啶-N-糖基酶UUdenaturedumpfragment1200baseOkazakifragmentungdumpfragmentlongerdutdumpfragmentshorterAApulse-labelingindT-H3？

leadingstrand（indUMPF.）laggingstrand（inO.F.）Lig（ts）？

直接证据？

DNAsemi-discontinuousreplicationleadingstrand,laggingstrand均有均有dUMP的掺入的掺入Okazaki片段在某种意义上为片段在某种意义上为dUMP片段片段先导链按先导链按dUMP片段连续复制片段连续复制后随链按后随链按Okazaki片段不连续复制片段不连续复制（Prok.1-2kb,Euk.0.1-0.2kb）3.4.DNA复制的方式复制的方式（DNAreplicationmodel）primerDNA聚合酶不能发动聚合酶不能发动子链子链DNA的复制起始的复制起始!

E.coliRifsRifS+M13E.coliE.coliRifRM13+S.S.DNAvirus+RF无M13RFRifampinM13Rifampin有M13RF有M13RFM13RifampinRifampin是是E.coliRNApolymerase的的抑制抑制剂剂M13RF的形成需要的形成需要RNApolymerase发动合成一发动合成一段段RNA分子作为引物分子作为引物RF启动后，启动后，RNA引物已经形成引物已经形成,Rifampin的抑制无的抑制无效效ConclusionThefirstevidencesupportingRNAprimingBeforeDNasedigestionAfterDNasedigestionDNA/RNAprimerlabeledtheintactprimersontheOkazakifragmentswith32pGTP.destroyedDNAwithDNase,leavingonlythelabeledprimers.genotypeRNaseHDNaseaande;

-+bandf;

+-candg;

-dandh;

+DNasecannotcompletelydestroyOkazakifragmentsTunekoOkazakiJ.Mol.Biol.184（1985）p.4913merRNAprimerlabeledwithP32新起始方式新起始方式（denovoinitiation）或或复制叉式复制叉式（replicationfork）startingpoint（Cairnsmodel,form,thedaform）RNAprimertranscriptionactivationleadingstrandforklaggingstrandmultiplerepliconEukaryote（500-5000bp/min）DNA复制的转录激活复制的转录激活（transcriptionalactivation）RNApolymeraseRifS10NtRNAprimerforleadingStrandorigindnaGprimaseRifRforlaggingStrandprimasomeSynthesisofprogenystrandinlaggingSynthesisofprogenystrandinlaggingDNADNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseRNApol（RNApolymerase）RifSdnaG（primase）RifR完成对后随链引物的合成完成对后随