完整版碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题.docx

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完整版碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题

碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用

及提取中可能出现的问题

一、质粒提取三种溶液的作用：

1.溶液I

溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA，pH8.0

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。

那么50mM葡萄糖是干什么的呢？

加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：

抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达10mM的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。

如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？

只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。

有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

1.溶液II

溶液II，0.2NNaOH，1%SDS

轮到溶液II了。

这是用新鲜的0.4N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。

要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。

如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。

有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?

那是为下一步操作做的铺垫。

这一步要记住两点：

第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

基因组DNA的断裂会带来麻烦。

1.溶液III

溶液III：

3M醋酸钾，2M醋酸

溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。

如果这样怀疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。

大量沉淀的出现显然与SDS的加入有关系。

如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？

在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。

因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。

但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。

这其实是十二烷基硫酸钠（SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。

如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。

这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？

是为了中和NaOH，因为长时间

的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。

基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。

所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。

很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。

NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。

溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。

这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。

酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。

至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

二、质粒提取常见问题解析

1、涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？

涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。

蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。

建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。

同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

2、原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?

这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。

解决办法：

（1）降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

（2）使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

（3）质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！

3、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？

（1）大肠杆菌老化：

涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

（2）质粒拷贝数低：

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

（3）菌体中无质粒：

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

（4）碱裂解不充分：

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。

对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

（5）溶液使用不当：

溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

（6）吸附柱过载：

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。

若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

（7）质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

（8）乙醇残留：

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

（9）洗脱液加入位置不正确：

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

（10）洗脱液不合适：

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10mMTris-HCl,1mMEDTA，pH8.5）或水。

洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。

当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。

洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

（11）洗脱体积太小：

洗脱体积对回收率有一定影响。

随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。

为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

（12）洗脱时间过短：

洗脱时间对回收率也会有一定影响。

洗脱时放置1min可达到较好的效果。

4、细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？

（1）很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。

（2）质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。

（3）判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。

如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。

（4）菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。

达到OD6001.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/II/III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。

5、为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？

提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：

（1）可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。

RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。

（2）可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．

（3）可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。

（4）如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法（比如高温或者低温研磨等）,然后使用一般的发放。

（5）可能质粒随乙醇一起倒掉了。

6、加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？

（1）问题可能是发生在溶液II上。

首先看看10％SDS是否是澄清的？

NaOH是否是有效的？

如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？

（2）可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。

（3）可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。

这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。

7、抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？

怎样使用酚与氯仿较好？

酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当