小体和PAS整理Word格式文档下载.docx
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4.剂量补偿(dosagecompensationeffect)
女性有两条X染色体,但所表达的绝大部分遗传物质与只有1个X染色体的男性是一样多的。
这种男女X连锁基因产物相等的现象在遗传学上称为剂量补偿。
5.X小体的应用
(1)鉴定个体的性别
胎儿细胞性染色体检查:
羊水细胞,绒毛细胞,用于预防性染色体遗传性疾病的发生,优生。
(2)诊断性染色体异常综合征
克氏(Klinefelter’s)综合征,先天性睾丸发育不全综合征,患者为男性但有一个巴氏小体,核型是47,XXY。
特纳氏(Turner’s)综合征,先天性卵巢发育不全综合征,患者为女性但却无巴氏小体,核型是45,XO。
超雌:
XXX,XXXY有2个巴氏小体等。
二.实验材料
取材:
女性口腔粘膜上皮细胞
试剂:
0.85%生理盐水,低渗液0.075MKCl,Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶l,现配),5M盐酸,0.2%甲苯胺兰染液
耗材:
牙签、离心管、载玻片、染色缸
仪器:
恒温水浴箱,离心机,光学显微镜
三.实验方法
0.075MKCl
1.取材:
吸取5ml生理盐水于离心管中,漱口后用牙签钝端从口腔两侧颊部刮取女性口腔粘膜上皮细胞4-5次,置入离心管的生理盐水中洗脱下来,轻轻摇匀,1000r/min离心10min,弃上清。
2.低渗:
加入5ml预热的低渗液,轻轻混匀,37℃低渗10min。
甲醇∶冰乙酸=3∶l,现配
(低渗液的作用:
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展,同时可使粘附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态)
3.固定:
终止KCl进一步低渗
(1)加入新鲜配制的Carnoy固定液1ml,混匀,室温预固定2min,1000r/min离心8min,弃上清
(2)加入固定液5ml,吹打混匀,室温固定15min,1000r/min离心10min,弃上清。
(3)加入固定液0.5-1ml,混匀,制成细胞悬液。
(固定液的作用:
固定液的重要特性是能迅速穿透细胞,使蛋白凝固,终止细胞代谢过程,并保持细胞核染色体结构的完整性,并且能够增强染色体的嗜碱性,达到优良的染色效果。
)
4.滴片:
吸取细胞悬液自10—20cm高垂直向下滴在一张预冷的载玻片上(2-3滴),标记,空气风干或烘干。
(目的:
从高处向下滴片,让液体分散开:
形成细胞单层,使染色体分散,便于
观察。
用冰片:
是降低液体的表面张力。
课件上是细胞壁,我觉得应该是细胞膜
5.水解:
玻片放入盐酸缸中,室温水解10min后取出,自来水细水漂洗数秒钟,洗去多余盐酸,空气风干或烘干。
(水解可除去细胞间的果胶质,使细胞壁软化或部分分解,从而使细胞和染色体易于分散,同时可去除杂质。
6.染色:
玻片放入甲苯胺兰染液缸中,染色3min后取出,自来水细水漂洗数秒钟,空气风干或烘干。
(甲苯胺兰是一种碱性染料,与细胞核蛋白(酸性)结合,染成紫蓝)
7.镜检:
低倍镜→高倍镜。
四.注意事项
1.取材前需用水漱口数次,尽可能除去细菌和食物残渣;
用洁净的牙签钝端从口腔两侧颊部刮取粘膜,为防止后面的离心损耗,应尽量多取一些。
2.弃上清时,用吸管吸取上清,弃去,接近下方沉淀时,应小心吸取。
3.加入低渗液后,轻轻混匀,不能太用力,以防核膜破裂。
4.固定液使用前需临时配制,长时间放置影响固定效果。
5.载玻片于临用前在-20度冰箱中取出,现用现取,以防温度上升。
6.加热时应距离外焰一段距离(2-3cm),且来回摆动,以防过热引起断裂。
五.实验结果
1.实验结果的观察:
低倍镜:
选择轮廓清楚,不重叠,染色清晰,核膜完整,核质中颗粒均匀的细胞,观察到细胞核后转到高倍镜下观察。
高倍镜:
观察X小体,大小约为1μm,扁平状、椭圆形或三角形,浓染,紧贴于细胞核核膜边缘。
2.X小体的形状:
3.X小体的阳性率:
正常女性口腔粘膜上皮细胞中X小体阳性率约10%~30%
男性偶尔可见,阳性率<2%,且形态不典型。
糖原的显色——PAS反应(PPT内容)
石蜡切片法:
以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将标本切成薄片,经一系列处理制成永久切片
是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法
制作过程:
1.取材→2.固定→3.洗涤→4.脱水→5.透明→6.浸蜡→7.包埋→8.切片→9.贴片→10.脱蜡复水→11.染色→12.脱水→13.透明→14.封片。
(脱水的方法?
透明所用的试剂?
脱蜡复水的方法?
HE染色原理?
从人或动物体内取下所需组织或器官,材料必须新鲜,组织块不宜太大,以便固定剂穿透。
固定:
目的:
迅速凝固蛋白质,终止细胞一切代谢过程,防止组织自溶,保持其活体时结构。
固定剂:
10%甲醛、80%酒精、混合固定剂(Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液)。
用量:
必须充足,一般为材料块的20~30倍。
固定时间:
数小时至24小时。
洗涤:
除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,以免影响后面的染色效果。
方法:
多数用流水冲洗,少数用酒精。
脱水:
固定或洗涤后的组织内充满水分,而水与石蜡不能互溶,所以必须将组织中的水分除去,才能进行石蜡包埋。
脱水剂:
酒精
从低浓度到高浓度梯度酒精脱水:
30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%各级酒精中放置1~数小时。
水酒精石蜡
透明:
酒精与石蜡不相溶,还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液,替换出组织内的酒精。
组织在这类媒浸液中浸渍,出现透明状态,因此该过程称透明。
透明剂:
二甲苯。
酒精二甲苯等量混合液(1:
1)15分钟,二甲苯30分钟。
水→酒精→二甲苯→石蜡
浸蜡:
除去组织中的透明剂,使石蜡渗透到组织内部,达到饱和程度以便包埋。
石蜡二甲苯等量混合15分钟,石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ各30分钟。
浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行,以利石蜡浸入组织内(石蜡的熔点在50~60℃之间)。
包埋:
将浸蜡后的组织块包埋于石蜡中。
取出组织块,置于盛有融化石蜡的包埋框中,迅速放入冷水中冷却,待石蜡完全凝固(约30min)后取出,即做成含有组织块的蜡块标本。
切片:
将蜡块装在切片机上,调整所需的切片厚度(4~10um),进行切片,切出一片接一片的蜡带,用刀片割开蜡带。
贴片:
借助粘附剂将展平的蜡片粘附于载玻片上,以免在以后的操作步骤中脱落。
在洁净的载玻片上涂抹薄层粘附剂(如多聚赖氨酸),滴两滴蒸馏水于载玻片上,把蜡片放于水滴上,略加温使蜡片铺展,将载玻片放入温箱中干燥。
脱蜡复水:
染色液多数为水溶液,因此染色前必须将组织中的蜡脱去,才能进行染色。
与脱水浸蜡过程正好相反:
二甲苯Ⅰ、Ⅱ30min→100%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水各2min。
石蜡→二甲苯→酒精→水
染色:
使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。
经典的HE染色法:
苏木精(Hematoxylin)伊红(Eosin)
↓↓
碱性染料酸性染料
细胞核中的DNA、RNA等细胞质、膜性结构等
嗜碱性物质(本身酸性)嗜酸性物质(本身碱性)
染成蓝色染成红色
脱水透明封片:
去除水分,透明组织,便于观察和长期保存标本。
脱水:
95%酒精2分钟→100%酒精2分钟
透明:
二甲苯I2分钟→二甲苯II2分钟
封片:
将载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸,迅速地在切片的中间滴一滴中性树胶,拿起盖玻片,缓慢倾斜放下,避免产生气泡。
其他制片技术:
涂片(血涂片)铺片(肠系膜可用)磨片(骨)
石蜡切片与冷冻切片:
石蜡切片的制作相对比较复杂,而冷冻切片的制作相对简单,快。
但是石蜡切片可以永久保存,而冷冻切片则不能。
在考虑用哪一种方法时要看取材容不容易,是否保留等问题。
组织化学技术(histochemistry)应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分,并进行定位、定量及相关功能研究的一种实验技术。
免疫组织化学(immunohistochemistry)
利用抗原(antigen,Ag),抗体(antibody)特异结合的原理,用已知抗体检测未知抗原的一种方法。
(标记物为荧光素、过氧化物酶或金颗粒)
过碘酸-Schiff反应(periodicacidSchiffreaction,PAS反应)
原理:
PAS反应是经典的组织化学方法,用来显示组织细胞中的多糖或糖蛋白。
原理是含有乙二醇基的糖类,在过碘酸的作用下,经氧化而产生双醛基,醛基进而与亚硫酸品红(Schiff试剂)结合,使无色液体变成紫红色染料,并沉着于含有多糖或糖蛋白的细胞或组织结构上。
PA(过碘酸)Schiff试剂(亚硫酸品红)
乙二醇醛基紫红色沉淀(PAS阳性反应)
氧化
应用:
可根据紫红色的位置及深浅鉴定糖成分的分布及相对含量,用于心血管疾病、糖尿病以及某些肿瘤的诊断和研究
PAS染色的方法
1.脱蜡,石蜡切片于染色前经二甲苯脱蜡30min
2.复水,在浓度逐级降低的酒精内分别停留数分钟(100%90%80%70%)
3.过碘酸氧化10分钟
4.蒸馏水洗3分钟
5.Schiff试剂避光染色10分钟
6.0.5%偏重亚硫酸钠溶液浸洗3次(I、II、III),每次2分钟
7.自来水洗3次,每次1分钟,蒸馏水洗1分钟
8.苏木精染色1分30秒
9.自来水洗3次,每次1分钟,蒸馏水洗1分钟
10.梯度脱水:
95%酒精2分钟→100%酒精2分钟,
11.中性树胶封片,显微镜下观察(低倍镜→高倍镜)
(结果:
糖原颗粒被Schiff试剂染色呈紫红色,细胞核被苏木精染色呈蓝色,其他背景呈淡粉红色)
观察的标本:
肝和肺:
脾+,肝+++(PAS染色不仅对多糖染色,而且对糖蛋白也染色,脾有少量糖蛋白,呈弱阳性。
而肝是糖类合成的部位,因此阳性强,且在肝血管周围呈放射状分布)
肠道杆菌、霍乱弧菌、3种厌氧菌
一.肥达反应
用已知伤寒沙门菌O、H抗原,以及引起副伤寒的甲型、乙型副伤寒沙门菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量凝集试验,测定受检血清中有无相应的抗体及其效价的试验。
用于辅助诊断伤寒和副伤寒
(H抗原:
鞭毛蛋白,不稳定。
O抗原:
LPS成分,稳定)
倍比稀释法:
123456
生理盐水0.50.50.50.50.50.5
血清0.5(吹打)0.50.50.50.50.5(