生物化学试验指导手册Word文档格式.docx

生物化学试验指导手册Word文档格式.docx

《生物化学试验指导手册Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学试验指导手册Word文档格式.docx（27页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。

取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。

4.乙醇-乙醚混合液

乙醇：

乙醚=1：

1（体积比）。

五、操作步骤

1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至40℃再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7（用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整）。

观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。

将上述悬浮液冷却至室温。

离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。

2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液。

3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。

用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。

4.将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白精制品。

5.称取所获酪蛋白的质量（g）。

六、计算含量和得率：

酪蛋白含量（g/ml）=酪蛋白（g）/50ml×

100%；

得率=测得含量/理论含量×

100%。

七、实验注意事项：

1.离心管中装入样品后必须严格配平，否则对离心机损坏严重；

2.离心管装入样品后必须盖严，并擦干表面的水分和污物后方可放入离心机。

3.离心机用完后应拔下电源，然后检查离心腔中有无水迹和污物，擦除干净后才能盖上盖子放好保存，以免生锈和损坏。

八、思考题：

1.为什么调整溶液的pH可以将酪蛋白沉淀出来？

2.试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验。

实验二凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量

一、实验目的与要求：

1.掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。

2.掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵留在酸液中。

然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，用硼酸吸收。

。

吸收氨后的硼酸再以标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。

2NH2-（CH2）2-COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O

（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

三、样品：

面粉

四、仪器与试剂

仪器：

凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000W

试剂：

所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。

1.消化试剂：

浓H2SO4硫酸铜（固体）硫酸钾（固体）

2.2%硼酸（H3BO3）溶液:

10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。

3.30%NaOH溶液

4.0.01mol/L盐酸标准溶液

5.混合指示剂:

临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成（比例5：

1）．（公用）

五、测定方法

1、样品消化：

　　准确称取面粉0.2g左右放入干燥的定氮烧瓶中（勿粘附在瓶壁上），加入0.5gCuSO4、6gK2SO4及25mL浓硫酸，轻轻摇匀后，用消化炉以小火加热，待泡沫停止产生后，加大火力，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30分钟。

取50~60mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，以释放潜热，待样品冷至室温，移入250mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。

同时做一空白消化（空白消化只加试剂，不加样品）。

2、蒸馏与吸收：

加碱

加酸

（1）将所有的开关打开。

从样品加入口加入50mL的蒸馏水，产生蒸汽后，使蒸汽进入反应室，蒸馏洗涤10分钟。

然后排出废水。

马上从进样口加入蒸馏水约20mL，再次洗涤反应室，待水排出，反复操作3次，洗涤完毕。

（2）准确吸取20.0ml样品消化稀释液（或空白液）放入消化管托盘上，按功能键直接加入30%NaOH溶液40.0ml。

⑶在250mL锥形瓶内，加入2滴混合指示剂，按功能键直接加入20mL2%硼酸，将冷凝管下端插入到液面以下。

（4）从第一滴馏出液滴下开始计时，蒸馏10分钟，将冷凝管尖端提离液面,再蒸馏1分钟，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，洗液流入吸收液内，取下接收瓶。

（5）反复洗涤反应室后，再作样品平行测定。

测定完毕，停止加热，待冷却后拆除装置并洗涤干净。

3．滴定：

用0.0100mol/LHCl滴定吸收液至变为紫红色为终点，记下消耗的HCl体积。

平行实验进行数次。

注意：

定氮仪在使用前或每次平行实验后，应用蒸馏水及蒸汽洗涤干净方可进行样品测定的蒸馏操作。

洗净的标志：

吸收液不变颜色

四、计算：

公式自己推导。

蛋白质%=

C—HCl标准溶液的浓度，mol/L；

V1—滴定样品吸收液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；

V2—滴定样品空白液消耗的HCl标准溶液的体积，mL；

m—面粉的质量，g/mL；

　　　　0.01401－氮的毫摩尔质量；

F—小麦粉的蛋白质含量换算系数为5.70。

实验三蛋白质的颜色反应和沉淀反应

一、目的：

1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。

二、原理：

（一）蛋白质的颜色反应原理

蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。

颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。

颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。

（二）蛋白质的沉淀反应原理

蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（又称水化层）。

水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。

因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。

蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。

蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

三、仪器、试剂和材料

1.卵清蛋白液：

将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。

2.饱和硫酸铵溶液：

称硫酸铵850g加于1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

3.1%醋酸铅溶液

4.1%硫酸铜溶液

5.0.1%茚三酮溶液：

0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。

6.浓硝酸：

比重1.42。

7.试管及试管架、吸管、量筒、布氏漏斗。

四、操作步骤

（一）蛋白质的沉淀反应

1.盐析作用：

取1支试管加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。

过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

2.乙醇沉淀蛋白质：

取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许（加速沉淀并使沉淀完全）待溶解后再加入95%乙醇2mL混匀。

观察有无沉淀析出。

3.重金属盐沉淀蛋白质取：

2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。

（二）蛋白质的颜色反应

1.双缩脲反应

①取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。

至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。

然后加10%NaOH溶液1mL混匀，观察有无紫色出现。

②另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

注意事项：

硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu（OH）2。

此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu（NH3）42+，妨碍此颜色反应的观察。

2.蛋白质的黄色反应

在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色反应。

3.茚三酮反应

取1mL蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现（注意：

此反应必须在pH5～7进行）。

五、思考题：

1.能否利用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在？

为什么？

2.为什么蛋清可以作为铅或汞中毒的解毒剂？

实验四蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离

一、目的

1．学习水解蛋白质的方法。

2．掌握纸层析的基本技术。

3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。

二、原理

1．蛋白质的水解

蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。

实验室中常使用酸解法水解蛋白质。

当在6mol/L盐酸溶液中将蛋白质在110℃加热大约20h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。

酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L-氨基酸。

大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。

丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。

色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。

2．纸层析法分离氨基酸

纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。

它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。

在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数

层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。

滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；

而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。

层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动