优良菌种选育汇总Word文档下载推荐.docx

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⑥在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物，这样不但可以提高营养物质的有效转化率，还会减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品质量。

⑦在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数，提高单罐产量，降低成本具有重要意义。

⑧具有抗噬菌体感染的能力。

⑨菌株遗传特性稳定，以保证发酵能长期、稳定地进行，有利于实施最佳的工艺控制。

⑩菌种纯粹，不易变异退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。

这些都是对优良菌株特性的基本要求，也是菌种选育工作研究和需要解决的问题。

微生物菌种改良是微生物资源利用的关键步骤。

为生产目的产物，一般对所筛选出来的菌种都要进行菌种改良以提高其产率和改善其工艺性能。

推动工业菌株改良的主要动力是经济原因，发酵工程力求采用最经济、最有效的方式来取得最大的效益。

微生物工程菌种选育、改良的目的：

⑴提高产量

对微生物菌种进行选育改良，以过量生产（overproduction）或超量生产（super-production,hyper-production）目的产物。

产量效益是一切商业发酵过程所追求的首要目标，经济是菌种选育的主要推动力，是菌种选育不变的目的。

表征菌种经济性能的重要指标包括：

①浓度（concentration），指发酵终了产物的浓度，单位是g/L，得率越高，产品越浓，带来的好处是下游处理也相对容易；

②转化率（yield），指每单位质量的底物转化为目的产物的质量数值，单位是g/g，或者以百分率（%）表示，这一数值越高，表示菌种对原料的利用越有效，底物效率（Substrateefficiency）就越高；

③生产强度（发酵强度、生产率、生产能力，productivity），单位是g/（L·

h）,表示每升发酵液中每小时所得产物的质量（g）。

生产强度越大，达到相同产量所花费的发酵时间就越短。

要求目的产物的产量尽可能接近理论转化率。

通过菌种改良计划（可能需要几年时间）一般均可以明显提高产量，有时甚至可成百倍地提高。

⑵提高性能

除了产量以外，优异的服务性能也在考虑之列，如对用于杀虫和防腐作用的农业微生物菌种来说，则是毒力效价的提高、杀虫毒力的快速发挥、毒力的持久性、防治对象范围的扩大等。

⑶提高产物纯度

通过提高产物纯度，最大限度减少不需要的副产物的产生。

对抗生素而言，是提高有效组分的比例，减少产物类似物的产量。

例如，对于黑曲霉柠檬酸发酵，是防止草酸的生成，减少或消除色素，以有利于目的产物柠檬酸的分离、提取。

⑷改变菌种的性状以改善发酵过程

通过改变菌种的性状，可以改善发酵过程，主要涉及到以下方面：

①改变和扩大菌种所利用的原料结构，使之适应不同的原料，适应成分简单、来源广泛易得、价格低廉的培养基，以降低生产成本；

②改善菌种的生长速度，提高斜面孢子化程度，使生产菌种能产生大量有活力的繁殖体―细胞、芽孢、分生孢子等；

③以菌丝体形态发酵的真菌和放线菌，宜采用微小的球状菌丝体（penetform）,以增加菌丝体表面积，大大降低丝状菌丝体对发酵搅拌剪切力的敏感性，并降低发酵液翻性，少用消泡剂以及耐合成消泡剂；

④改善对氧的摄取条件，降低需氧量及能耗等；

⑤菌种要能耐不良培养条件，如抗噬菌体、耐高温、耐酸碱、耐自身代谢产物等；

⑥改变细胞产物分泌能力，使目的产物尽可能分泌到细胞外，降低产物抑制作用及有利于产物分离；

⑦菌种的遗传性状，特别是涉及生产的遗传性状稳定。

⑸改变生物合成途径以获得新产品

通过诱变，筛选代谢途径显著改变的突变体，使产生菌合成与原来分子结构有差异的代谢产物。

如从诱变产生柔红霉素（daunomycin，又名柔毛霉素，一种抗肿瘤抗生素）的波西链霉菌（Streptomycespeucetius）菌种，得到一种新的产物阿霉素（adriamycin，也称亚德里亚霉素），用于白血病、恶性淋巴病和一些肉瘤的治疗。

诱变紫苏霉素（sisomicin）产生菌伊钮小单孢菌（从Micromonosporainyoensis），得到结构不同的突变霉素（mutamycin），既扩大了抗生素的抗菌范围，又解决了耐紫苏霉素耐药菌所带来的问题。

组合生化（combinatorialbiochemistry）技术以已知有用化合物或已知骨架的化合物分别与不同的微生物共同培养，在不同培养时间化合物的结构及其活性发生变化（发生修饰或转化），组成新型分子，从而极大地增加了化合物的多样性，相应增加了获得理想化合物的可能性。

这一技术已崭露头角，发展迅速。

3-1自然选育

不经人工处理，利用微生物的自然突变（spontaneousmutation）进行菌种选育的过程称为自然选育（spontamtousselection）。

如图3-1所示。

自然选育在微生物的菌种选育中占很重要的地位，它是诱变育种的基础，而且贯穿于诱变育种的全过程。

所谓自然突变是指某些微生物在没有人工参与下所发生的某些突变现象，称它为自然突变决不意味着这种突变是没有原因的，一般认为引起自然突变有两个原因：

即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。

多因素低剂量的诱变效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线，各种短波辐射，低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变。

互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错记。

例如，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现；

胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。

平衡是倾向于酮式或氨基式的，因此DNA双链中以AT和GC碱基配对为主。

但在偶然的情况下，当下以烯醇式出现时的一瞬间，DNA链正好合成到这一位置上，与T配对的就不是A、而是G；

同样，若C以亚氨基式出现时的一瞬间，新合成的DNA链这一位置上，与C配对的就不是G，而是A，在DNA复制过程中发生的这种错误配对，应有可能引起自然突变，这种互变异构现象是无法预测的，对这种偶然事件作了大量的统计分析后，发现并掌握其中之规律，据统计，这种碱基对错误配对引起自然突变的几率为10-8~10-9。

调查研究（包括资料查阅）

　　　　　　　　↓

试验方案设计

　　↓

采样

增殖条件摸索—→第一次增殖培养

　　　　　　　↓

第一次平板分离——→第一次原种斜面

　　　　　　　　　　↓

第二次增殖培养

　　　　　　　↓

第二次平板分离

　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

定性或半是量测定——→初筛（1株八瓶）

　　　　　　　　　　　　↓

第三次平板分离

　　　　　　　　↓

第三次原种斜面

　　　　　　　　↓

复筛（1株3~5瓶）——→第三次原种株

（不纯）　↓

第四次平板分离

　　　　　　　　↓

第四次原种斜面

　　　　　　　　　　　　　　　　　↓

初步工艺条件摸索———→再复筛←——种子培养

　　　↓

较优菌株1~3棵

保藏及进一步做生产性能试验某些必要试验和

或作为育种的出发菌株毒性试验等

图3-1微生物工程自然选育菌种操作程序图

自然突变可能会产生两种截然不同的效果，一种是菌种退化导致目标产物产量或质量下降；

另一种是对生产有益的方向发展。

因此，为保证生产水平和稳定和逐步提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的选育优良的菌种。

自然选育的目的和意义在于：

⑴提高生产能力。

由于各种条件因素的影响，自然突变的经常发生，造成生产水平的波动，因此从高生产水平的批次中，分离出生产能力高菌种再用生产。

⑵纯化菌种，稳定生产，并作为诱变育种的出发菌种。

实践证明，纯的出发菌种比用遗传性能差的异核体作为出发菌效果较好。

⑶复壮菌种。

在微生物工程中，高产菌种退化一直是很严重的问题，防止菌种退化采用自然选育是一项积极的有效措施。

其不但能保持原菌种的生产能力，有时可能选育到超过原有生产能力和质量的优育菌种。

⑷巩固变种和杂种的优良特性。

通过诱变，杂交及其遗传方法育得的突变株，其遗传特性往往不太稳定，易发生回复突变种分离现象，导致生产能力的下降。

通过自然选育，可以纯化，巩固变种和杂种的优良遗传性，有效地选择分离高性能的突变株。

自然选育的方法，常用的有两种：

单菌落分离法和单孢子分离法。

单菌落分离法的操作程序是，将菌种制成菌悬液，用稀释法在团体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。

单孢子分离法的操作程序是，借助显微操作仪器，在显微镜下挑取单孢子或菌体，进行单独培养，进而选育优良菌种。

总之，自然选育是一种简单易行的选良方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。

但是，其最大缺点是选育效率低，因此经常与诱变育种交替使用，以提高育种效率。

3-2诱变育种

目前应用于工业化的生产菌种几乎无不例外地都是经过诱变的改良菌种。

诱变育种是提高菌株生产能力，改进产品质量，扩大品种代谢，简化生产工艺，使所需要的某此特定的代谢产物过量积累的有效方法之一。

因为从自然环境中分离的菌种存在着生产能力有限，生长周期长等缺点，一般不能满足工业化生产的实际需要。

诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素、化学试剂和生物诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

表3-1例出常见的突变类型。

表3-1常见的突变类型

变异类型

变异形状

形态变异

菌落的形态变异

产孢子多寡和孢子颜色

菌落的颜色

菌落形态和表征结构等

鞭毛、孢子穗形态

荚膜、孢子大小和形态，菌体形态大小等

细胞膜透性

抗原构造等

生理生化变异

糖类分解能力

营养要求

代谢产物生产能力

色素变化及生产能力

温度敏感性

抗性变异

耐药性

噬菌体抗性

对紫外线的抗性

致病性变异

毒性生产能力

表面抗原

3.2.1.诱变育种的原理

诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。

突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。

染色体畸变是指染色体或DNA片段