TUNEL染色.docx

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TUNEL染色

相关疾病：

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产品名称：

罗氏（Roche）公司Tunel试剂盒英文名称：

Tunel产品货号：

产品规格：

50T试剂级别：

试剂级产品产地：

USA产品商标：

RocheInsitucelldeathdetectionkit-POD法一、原理：

TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdTEnzyme）的作用下，能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH结尾，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反映产生很强的颜色反映（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因此没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评判，和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。

二、器材与试剂器材：

光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：

试剂盒含TdT10×、荧光素标记的dUTP1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：

PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH）或细胞通透液（%TritonX-100in%sodiumcitrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。

三、实验步骤操作流程图：

制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：

上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、时刻、浓度均需试探）或加细胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反映混合液，处置组用50μlTdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μlDNase1，反映在15~25℃×10min，后面步骤同处置组。

7.玻片干后，加50μlTUNEL反映混合液（阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×1h。

8.PBS漂洗3次；9.能够加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10.玻片干后加50μlconverter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映37℃×30min。

11.PBS漂洗3次；12.在组织处加50~100μlDAB底物，反映15~25℃×10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后当即用自来水冲洗。

梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观看凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。

可结合凋亡细胞形态特点来综合判定（未染色细胞变小，胞膜完整但显现发泡现象，晚期显现凋亡小体，贴壁细胞显现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）关于培育细胞的预处置：

①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保留；②适当方式诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心搜集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞专门好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在%的TritonX-100（见备注5）中处置5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作犹如石蜡包埋切片的6—15四、注意事项1.进行PBS清洗时，每次清洗5min。

2.PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。

3.在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4.TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。

不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。

5.如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。

6.用甲基绿（MethylGreen）染液（3-5%甲基绿溶于醋酸巴比妥）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。

然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观看操作。

若是现在利用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。

7.荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。

8.试剂保留；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter-POD液一旦解冻，以后就保留在4℃（2~8℃）下，至少在6m内稳固，幸免再次冻存；TUNEL反映液临用前配好后，放至冰上直至利用。

9.结果分析时注意：

在坏死的晚期时期或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引发假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，和细胞外的矩阵成份阻止TdT进入胞内反映，进而产生假阴性结果。

能够选择利用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的成效超级的好，价钱也有优势，若是有需要能够联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），能够为您的实验提供更多的选择性，希望能够帮到您！

A、B二液混合，30μl/每片37℃1h

PBS洗3×3min

Streptavidin-HRP1:

20037℃30min

PBS洗3×3min

%DAB+%H2O2显色10min，水洗

苏木素衬染1min，水洗蓝化

吹干后常规树脂封片

观看：

凋亡指数（apoptosisinde×，AI）在一般光镜下持续观看10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。

其他

IRAM:

我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：

细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）--3%H2O2in甲醇室温10分钟%-100in%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反映混合物，37度湿盒90分钟--加入POD，37度湿盒40分钟--加入DAB100微升，室温10分钟--苏木素2分钟。

其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。

 我做了两次，但成效均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不明白是怎么回事。

是我的试剂没有配对仍是染色出了问题？

Nevin:

因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见：

一、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方式仿佛有点问题，我以为H2O2的浓度偏高，有两种选择：

A，%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。

请注意浓度的转变。

因为H2O2会减弱TdT的活性，可致假阴性。

二、加入TUNEl反映液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。

这也是tunel成功的关键。

3、能够用蛋白酶K消化试试。

totoo:

我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反映。

蛋白酶k消化的浓度20ug/ml.10ug/度30分钟。

我的正常的角膜应该有阳性的结果，可是没有阳性？

midas:

对角膜进行的什么处置？

能够先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，若是能够染出来那么能够证明您的盒子应该是没有什么问题的。

totoo:

我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果

pljgirl：

请教列位大侠：

有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？

我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反映，可是他们得石蜡阳性片我染的专门好，确实是细胞片不怎么着色？

我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？

newfish：

我用的是中山的蛋白酶K不是石蜡片采纳么？

细胞不用吧！

做那个实验有几个关键的地址，不能干片固定咱们一样用4％多聚甲醛30分钟。

染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观看看到染上了再终止。

另外你能够用苏木素复染！

！

DONGHAIJU：

我此刻正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringermannheim公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反映，你的实验步骤是如何进行的？

可否写下来讨论一下缘故？

刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，成效也不错。

我的实验步骤可能如下：

一、石蜡切片脱蜡至水，

二、%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，lPBS清洗两次，每次5分钟

3、20ug/ml蛋白酶K处置，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗，

4、加入TUNEL反映混合液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育1小时，PBS清洗，

五、3%BSA室温作用20min,PBS清洗

六、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗

7、DAB显色5~10min，自来水冲洗，

八、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，

九、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%

（1），100%

（2），2min/次

二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观看。

大灵通：

我想做细胞爬片，然后加不同浓度增进凋亡的药物，然后做TUNEL检测凋亡情形。

问题有二：

一、随药物浓度升高，凋亡比例愈来愈高（我做流式取得的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会可不能阻碍TUNEL结果？

不明白我说明白没有？

确实是说尽管调亡细胞增多，可是漂的愈来愈多，玻片从培育液里拿出来细胞都留在培育液里了！

可是文献上也都是这么做的呀。

他们的细胞莫非凋亡了也都留在片子上的么？

二、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的仍是常温的？

我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？

zhaoqingshan：

其实，确实是如此的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，或许在分岔口就已经离开贴壁了。

有两点建议：

一、听说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的；

二、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可；

3、显然，凋亡的细胞大多数已经离开玻璃片了，因此应该把漂浮起来的细胞搜集，然后甩片