TUNEL染色.docx

1、TUNEL染色相关疾病：产品名称： 罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒英文名称： Tunel产品货号： 产品规格： 50T试剂级别： 试剂级产品产地： USA产品商标： RocheIn situ cell death detection kit-POD法一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡初期进程中细胞核DNA的断裂情形。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸结尾转移酶（TdT Enzyme）的作用下，能够连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH结尾，并与连接辣

2、根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反映产生很强的颜色反映（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因此在光学显微镜下即可观看凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因此没有3-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评判，和通过双色法确信细胞死亡类型和分化时期。二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各

3、种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10、荧光素标记的dUTP 1、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 l 20DAB+1L 30%H2O2+94 l PBS）、Proteinase K工作液（10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl， pH ）或细胞通透液（% Triton X-100 in % sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH ， 10 mM MgCl

4、2，1 mg/ml BSA）等。三、 实验步骤操作流程图：制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透加TUNEL反应液加converter-POD与底物DAB反应显色光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在2137C（温度、时刻、浓度均需试探）或加细胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制备TUNEL反映混合液，处置组用50l TdT+450l 荧光素标记的dUT

5、P液混匀；而阴性对照组仅加50l 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100l DNase 1，反映在152510min，后面步骤同处置组。7. 玻片干后，加50l TUNEL反映混合液（阴性对照组仅加50l 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映371h。8. PBS漂洗3次；9. 能够加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450500nm，检测波长为515565nm）；10. 玻片干后加50l converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反映3730min。11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50100lDAB底物，反映1

6、52510min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后当即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观看凋亡细胞（共计200500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特点来综合判定（未染色细胞变小，胞膜完整但显现发泡现象，晚期显现凋亡小体，贴壁细胞显现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）关于培育细胞的预处置：在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4保留；适当方式诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心搜集约1

7、106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞专门好的吸附到载玻片上；将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；PBS浸洗二次，每次5min；将吸附细胞的载玻片在%的Triton X-100（见备注5）中处置5min；PBS浸洗二次，每次5min；后续操作犹如石蜡包埋切片的615四、 注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又

8、可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于 醋酸巴比妥 ）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观看操作。若是现在利用8090%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保留；未打开的试剂

9、盒贮存在-20（-1525）；converter -POD液一旦解冻，以后就保留在4（28）下，至少在6 m内稳固，幸免再次冻存；TUNEL反映液临用前配好后，放至冰上直至利用。9. 结果分析时注意：在坏死的晚期时期或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN*断，从而引发假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，和细胞外的矩阵成份阻止TdT进入胞内反映，进而产生假阴性结果。能够选择利用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的 成效超级的好，价钱也有优势，若是有需要能够联系上海开放生物-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连

10、接臂长度的产品），能够为您的实验提供更多的选择性，希望能够帮到您！A、B二液混合，30l/每片 37 1hPBS洗 33minStreptavidin-HRP 1:200 37 30minPBS洗 33min% DAB+%H2O2显色10min，水洗苏木素衬染1min， 水洗蓝化吹干后常规树脂封片观看：凋亡指数（apoptosis inde，AI）在一般光镜下持续观看10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。其他IRAM: 我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）-3%H

11、2O2in甲醇室温10分钟%-100in%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟-加入TUNEl反映混合物，37度湿盒90分钟-加入POD，37度湿盒40分钟-加入DAB100微升，室温10分钟-苏木素2分钟。其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。我做了两次，但成效均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不明白是怎么回事。是我的试剂没有配对仍是染色出了问题？Nevin: 因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见：一、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方式仿佛有点问题，我以为

12、H2O2的浓度偏高，有两种选择：A，%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。请注意浓度的转变。因为H2O2会减弱TdT的活性，可致假阴性。二、加入TUNEl反映液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。这也是tunel成功的关键。3、能够用蛋白酶K消化试试。totoo: 我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反映。蛋白酶k消化的浓度20ug/ml .10ug/度30分钟。我的正常的角膜应该有阳性的结果，可是没有阳性？midas: 对角膜进行的什么处置？能够先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，若是能够染出来那么能够证明您的盒子应该是没

13、有什么问题的。totoo: 我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果pljgirl：请教列位大侠：有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反映，可是他们得石蜡阳性片我染的专门好，确实是细胞片不怎么着色？我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？newfish：我用的是中山的 蛋白酶K不是石蜡片采纳么？细胞不用吧！做那个实验有几个关键的地址 ，不能干片 固定咱们一样用

14、4多聚甲醛30分钟。染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观看看到染上了再终止。另外你能够用苏木素复染！DONGHAIJU：我此刻正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringer mannheim 公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反映，你的实验步骤是如何进行的？可否写下来讨论一下缘故？刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，成效也不错。我的实验步骤可能如下：一、石蜡切片脱蜡至水，二、%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，lPBS清洗两次，每次5分钟3、20ug/ml蛋白酶K处置，湿盒内37孵育30min，PBS清洗，4、加入TUNEL反映混合

15、液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37孵育1小时，PBS清洗，五、3%BSA室温作用20min,PBS清洗六、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37孵育30min，PBS清洗7、DAB显色510min，自来水冲洗，八、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min，九、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%（1），100%（2），2min/次二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观看。大灵通：我想做细胞爬片，然后加不同浓度增进凋亡的药物，然后做 TUNEL检测凋亡情形。问题有二：一、随药物浓度升高，凋亡比例愈来愈高（我做流式取得的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会可

16、不能阻碍TUNEL结果？不明白我说明白没有？确实是说尽管调亡细胞增多，可是漂的愈来愈多，玻片从培育液里拿出来细胞都留在培育液里了！可是文献上也都是这么做的呀。他们的细胞莫非凋亡了也都留在片子上的么？二、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的仍是常温的？我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？zhaoqingshan：其实，确实是如此的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，或许在分岔口就已经离开贴壁了。有两点建议：一、听说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的；二、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可；3、显然，凋亡的细胞大多数已经离开玻璃片了，因此应该把漂浮起来的细胞搜集，然后甩片