贵州省高三生物一轮复习 第四十讲 基因工程原理及技术.docx

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贵州省高三生物一轮复习第四十讲基因工程原理及技术

第四十讲基因工程原理及技术

考纲要求

1．基因工程的诞生（Ⅰ）。

2.基因工程的原理及技术（Ⅱ）。

知识梳理

一.基因工程的基本工具

1.限制性核酸内切酶

（1）来源：

主要从原核生物中分离纯化而来。

（2）作用：

识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（3）结果：

产生黏性末端或平末端。

2.DNA连接酶

（1）作用：

将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。

（2）类型

常用类型

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

功能

连接黏性末端

连接黏性末端和平末端

结果

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

3.载体

（1）常用载体——质粒①化学本质：

双链环状DNA分子

②特点:

能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因

（2）其他载体：

λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

深度思考

如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，则图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序如何？

提示限制性核酸内切酶能将DNA分子切割为DNA片段，符合图中①；DNA聚合酶在DNA复制过程中将脱氧核苷酸连接成DNA链，符合图中④；DNA连接酶能连接不同的DNA片段，符合图中②；解旋酶能打开DNA双链形成DNA单链，符合图中③。

故正确顺序应为①④②③。

二.基因工程的操作程序

1.目的基因的获取

（1）目的基因：

主要是指编码蛋白质的基因。

（2）获取方法：

①从基因文库中获取目的基因

②利用PCR技术扩增目的基因

③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成

2.基因表达载体的构建——基因工程的核心

（1）基因表达载体的组成：

目的基因、启动子、终止子、标记基因等。

①启动子：

a．位置：

位于基因的首端。

b．作用：

是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。

②终止子：

a．位置：

位于基因的尾端。

b．作用：

使转录在所需要的地方停止下来。

（2）构建目的：

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；

②使目的基因能够表达和发挥作用。

3.将目的基因导入受体细胞

（1）转化：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

（2）常用方法（连线）：

受体细胞　　　　　　　　导入方法

①动物细胞　　　　　　a．农杆菌转化法

b．显微注射法

②植物细胞c．基因枪法

d．感受态细胞法

　（Ca2＋处理法）

③微生物细胞e．花粉管通道法

【提示】　①－b　②－a、c、e　③－d

4.目的基因的检测与鉴定

方法

检测或鉴定目的

水平

DNA分子杂交技术

检测目的基因的有无

分子水平

分子杂交技术

目的基因是否转录

抗原——抗体杂交

目的基因是否翻译

抗虫或抗病接种实验

是否具有抗虫抗病特性

个体水平

深度思考

基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。

已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

请据图分析：

切割目的基因时宜选择限制酶Ⅰ还是限制酶Ⅱ切割质粒呢？

请说明理由。

提示　由题图及题干信息知，目的基因两侧分别含—GGATCC—序列和－GATC－序列，若使用酶Ⅰ切割，只能切断一侧，不能切断另一侧，若使用酶Ⅱ切割，则可同时切断两侧，从而切出目的基因，同理，质粒中也含两种酶识别位点，且两识别位点均位于标记基因部位。

若使用酶Ⅱ切割质粒，则可同时破坏两个标记基因，使用酶Ⅰ切割则可保留GeneⅠ作标记基因，故切割目的基因应选择酶Ⅱ，切割质粒应选择酶Ⅰ。

要点精析

1.五种DNA相关酶的比较

作用底物

作用部位

形成产物

限制酶

DNA分子

磷酸二酯键

黏性末端或平末端

DNA连接酶

DNA片段

磷酸二酯键

重组DNA分子

DNA聚合酶

脱氧核苷酸

磷酸二酯键

子代DNA

DNA解旋酶

DNA分子

碱基对间的氢键

形成脱氧核苷酸单链

DNA（水解）酶

DNA分子

磷酸二酯键

游离的脱氧核苷酸

2.限制酶和DNA连接酶之间的关系图示

（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。

（2）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（3）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（4）DNA连接酶起作用时，不需要模板。

3.载体

（1）作用：

①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。

②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。

（2）具备的条件：

条件

适应性

稳定并能复制

目的基因稳定存在且数量可扩大

有一个至多个限制酶切割位点

可携带多个或多种外源基因

具有特殊的标记基因

便于重组DNA的鉴定和选择

4.限制酶选择的注意事项

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

易错警示！

　基因工程操作基本工具的8个易错点

（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。

（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。

（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。

（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。

（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。

（6）限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。

（7）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。

基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

（8）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。

5.基因工程操作的基本步骤

（1）目的基因的获取

目前有两种途径：

一是直接提取目的基因，如从基因文库中获取。

二是人工合成目的基因，常用的方法有化学合成法和反转录法。

（2）基因表达载体的构建

①基因表达载体的组成

②构建过程

（3）将目的基因导入受体细胞

细胞类型

常用方法

受体细胞

转化过程

植物细胞

农杆菌转化法

体细胞

将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上

动物细胞

显微注射技术

受精卵

将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物

微生物细胞

Ca2＋处理增大细胞壁通透性

原核细胞或酵母菌

用Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收

（4）目的基因的检测与鉴定

试题精粹

1.下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是（　　）

A．用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个

B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大

C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同

D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒

2.限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。

如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。

适于作为图示目的基因载体的质粒是（　　）

3.（2014·山东文登三模，35）在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。

如图为获得抗虫棉的技术流程。

请据图回答。

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：

目的基因的获取、________、将目的基因导入受体细胞、______________。

（2）A过程需要的酶有________和________。

（3）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用________处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为________态；然后将________在缓冲液中混合培养完成转化过程。

（4）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]________和[E]________。

如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入________。

（5）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是______________。

这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________。

4.（2015·河北唐山重点中学联考，51）下图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题。

（1）图中cDNA文库________基因组文库（填“大于”“等于”或者“小于”）。

（2）①过程提取的DNA需要__________的切割，B过程是________。

（3）为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法。

目的基因获取之后，需要进行________，其组成必须有__________________________

以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。

（4）将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。

5.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。

（1）若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割抗虫基因。

①过程在________（填“体内”或“体外”）进行。

（2）通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若大肠杆菌能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入，该培养基从功能方面属于________培养基。

（3）重组质粒导入大肠杆菌的目的是______________________。

（4）⑤过程所用技术称为________，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有________________。

6.（2015·福建质检，33）为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。

其基本流程如下图：

（Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达）

请回答：

（1）重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________（需要/不需要）启动子。

（2）步