肿瘤细胞凋亡交流.docx

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肿瘤细胞凋亡交流

一、细胞凋亡的形态学检测

二、1光学显微镜和倒置显微镜

三、　　

（1）未染色细胞：

凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。

四、贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

五、　　

（2）染色细胞：

常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。

凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割

六、成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

七、　　2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

八、　　一样以细胞核染色质的形态学改变成指标来评判细胞凋亡的进展情形。

九、　　常用的DNA特异性染料有：

HO33342（Hoechst33342），HO33258（Hoechst33258）,DAPI。

三各类染料与DNA的结合是非嵌入式的，要紧结合在DNA的A-T碱基区。

紫外光激发时发射敞亮的蓝色荧光。

十、　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10ug/ml。

Hoechst33258染色

1．原理33258和Hoechst33342均为非嵌人性荧光染料。

它们在活中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。

活细胞或固定细胞都可从低浓度溶液中摄取该染料。

从而使细胞核着色。

故又把此类染料称为DNA探针。

Hoechst33342和Hoechst33258都可溶于水并在水溶液中维持稳固。

Hoechsr-DNA的激发和发射波长别离550nm和460nm。

在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。

2．溶液的配制

（1）Hoechst33258贮存液

Hoechst33258lmg

0．01mol／LPBS（pH7．4）5ml

（2）Hoechst33258工作液（终浓度为0．5ug／ml）

Hoechst33258浓缩液125ul

0．01mol／LPBS（pH7．4）50ml

3．操作程序

（1）细胞悬液或培育单层细胞等标本，用醋酸—乙醇或Carnoy固定液固定；

（2）0．01mol／LPBS漂洗5分钟；

（3）Hoechst33258工作液染色，室温15分钟；

（4）0．01mol／LPBS漂洗3次，每次5分钟；

（5）用甘油与PBS比例为1：

9的混合液或水溶性封片剂封片，荧光显微镜观看。

结果：

该染料为的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光

　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。

贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，利用终浓度一样为10ug/ml。

　　结果评判：

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：

Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图1）。

　　3透射电子显微镜观察

　　结果评判：

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构（图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

十一、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）

十二、

十三、　　磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。

Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依托性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

　　碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

　　方法

　　1悬浮细胞的染色：

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（~1×106）用PBS洗2次，加入100ulBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反映5min后，加入400ulBindingBuffer，当即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一样不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

　　2贴壁培养的细胞染色：

先用%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

　　3爬片细胞染色：

同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

　　结果[图4、图5]

　　注意事项

　　1.整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

　　2.操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

图4－－

图5－－

十四、线粒体膜势能的检测

十五、　　线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

十六、　　线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3，3-Dihexyloxacarbocyanineiodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester（TMRM）等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

十七、　　方法：

将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。

十八、　　注意事项

十九、　　1．始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

二十、　　2．与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。

二十一、DNA片断化检测

二十二、　　细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNAladder）。

细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNAladder的形成。

二十三、　　1.大分子染色体DNA片段的测定

二十四、细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。

所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。

线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限。

此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。

因此，细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。

通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。

那个方式是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。

每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向从头定向后，才能继续向前移动。

DNA分子量越大，这种重排所需要的时刻就越长。

当DNA分子变换方向的时刻小于电脉冲周期时，DNA就能够够按其分子量大小分开。

二十五、　　参考文献Brown,.,Sun,.,andCohen,.（1993）Dexamethasone-inducedapoptosisinvolvescleavageofDNAtolargefragmentspriortointernucleosomalfragmentation.J..268,3037-3039

二十六、　　2．DNALadder测定

二十七、　　方式：

收成细胞（1′107）沉淀?

细胞裂解液?

13000rpm′5min,搜集上清?

1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，

二十八、2h?

蛋白酶K（ml）37°C，2h?

1/10体积3M醋酸钠和倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，4°C过夜?

14000rpm′15min?

最后将沉淀溶解在TEbuffer中，加DNALoadingBuffer?

%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并照相。

二十九、　　结果：

[图6]

三十、　　参考文献HerrmannmM,LorenzHM,VollRetal.ARapidandsimplemethodfortheisolationofapoptoticDNAfragments.NucleicAcidRes.1994;22:

5506-5507

三十一、　　3．凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析

三十二、　　方式：

搜集细胞?

70%冷乙醇（inPBS）4°C固定留宿?

PBS洗涤，1000rpm′10min?

RNaseA（ml）37°C消化30min?

PI（50mg/ml）染色，室温避光15min?

FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的转变。

三十三、　　结果：

[图8]

三十四、　　4.ApoAlertTMLM-PCRLadderAssay（CLONTECH）

三十五、优点：

敏感度高，适合于检测少量样本，小部分凋亡细胞。

如临床活组织检测

8－－

五TUNEL法

　　细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

六、Caspase-3活性的检测（123三种方式同时利用仍是一种即可？

？

？

）

七、　（Hoechst-PI法在流式细胞仪上检测VSCaspase3法在流式细胞仪两种方式的不同性）

Caspase家族在介导细胞凋亡的进程中起着超级重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的初期时期，它被激活，活化的Caspase-3由两个大