蛋白质组学质谱问题个人总结DOCWord文档格式.docx

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酯、醛、酮>

芳香族化合物>

卤代物、醚>

烯>

饱和烃。

先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性要低，体积要小。

如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。

色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。

然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来.

2.反相色谱，是非极性固定相和极性流动相，用于分离非极性或者弱极性物质。

我想请教的是，如果流动相极性偏大，是不是分离效果不好？

还有就是如果分离度不好，加大水的比例，延长保留时间，会不会影响到分离效果？

对于液相色谱分离，影响因素多，有两点因素最影响分离，第一是物质与流动相的极性，第二个叫洗脱能力:

出峰快与慢以及分离效果，用极性来理解出峰顺序，反相色谱一般使用强度因子来表示，一般极性参数大的，强度因子就小，但甲醇与乙腈比较特殊，极性参数甲醇与乙腈分别为5.1与5.8，强度因子却是甲醇3.0，乙腈3.2。

所以说象你上面问的“如果流动相极性偏大，是不是分离效果不好？

”可以这样理解，流动相洗脱能力越强分离越不好。

而对于反相色谱来说，只有两相，一相是有机相，而另一相是水相。

有机相是强洗脱剂，水是弱洗脱剂。

当然有机相中的洗脱能力也是有差别的，按THF，ACN，MEOH顺序。

而不要用极性去理解，那样太复杂了。

有机相比例越大，洗脱能力越强，水相比例越大，洗脱能力越弱，但越容易分离。

3.在反相液相色谱中，固定相的极性小于流动相，洗脱顺序取决于溶质分子的疏水性，疏水性强的保留时间长！

4.分析色谱图

打开泵和检测器，快跑排除气泡，设置既定流速，稳定一段时间，让基线跑平，用液相针吸取称量融配脱气后的对照（含量已标定），打开定量环将液相针里的液体匀速注入定量环中，拔出针头立刻关闭六通阀，一般随六通阀关闭电脑自动采样，等主峰跑完整后记录其峰面积，一般跑两个对照，每个对照跑两针，共四针。

然后开始注称好溶配脱气后的样，以对照主峰的保留时间来判断样品中目标峰的位置，外标法以峰面积计算供试品中某物质的含量。

X=[S样*K/m样（1-水分）]*对照品含量%*100X:

供试品的含量（%）;

S样:

供试品的主峰面积;

K:

单位面积对照品的质量m样（1-水分）:

称取供试品折干后的质量（mg）;

X对:

对照品的含量（%）

5.什么是共沉淀？

共沉淀（coprecipitation），一种沉淀从溶液中析出时，引起某些可溶性物质一起沉淀的现象。

例如，用氯化钡沉淀硫酸钡时，若溶液中有K+、Fe3+存在，在沉淀条件下本来是可溶性的硫酸钾和硫酸铁，也会有一小部分被硫酸钡沉淀夹带下来，作为杂质混在主沉淀中。

2产生共沉淀的原因有：

①表面吸附，由于沉淀表面的离子电荷未达到平衡，它们的残余电荷吸引了溶液中带相反电荷的离子。

这种吸附是有选择性的：

首先，吸附晶格离子；

其次，凡与晶格离子生成的盐类溶解度越小的离子，就越容易被吸附；

离子的价数愈高、浓度愈大，则愈容易被吸附。

吸附是一放热过程，因此，溶液温度升高，可减少吸附。

②包藏，在沉淀过程中，如果沉淀剂较浓又加入过快，则沉淀颗粒表面吸附的杂质离子来不及被主沉淀的晶格离子取代，就被后来沉积上来的离子所覆盖，于是杂质离子就有可能陷入沉淀的内部，这种现象称为包藏，又叫吸留。

由包藏引起的共沉淀也遵循表面吸附规律。

例如，在过量氯化钡存在下沉淀硫酸钡时,沉淀表面首先吸附构晶离子Ba2+；

为了保持电中性，表面上的Ba2+又吸引Cl-；

如果晶体成长很慢，溶液中的硫酸钡将置换出大部分Cl-；

如果晶体成长很快,则硫酸钡来不及交换Cl-,就引起较大量的氯化钡的包藏共沉淀。

因为硝酸钡比氯化钡的溶解度小，所以钡的硝酸盐比氯化物更易被包藏。

③生成混晶，如果晶形沉淀晶格中的阴、阳离子被具有相同电荷的、离子半径相近的其他离子所取代，就形成混晶。

例如,当大量Ba2+和痕量Ra2+共存时，硫酸钡就可和硫酸镭形成混晶同时析出，这是由于二者有相同的晶格结构,Ra2+和Ba2+的离子大小相近的缘故。

共沉淀现象是玷污沉淀的主要因素，要通过沉淀反应在溶液中获得绝对纯的沉淀是不可能的。

在重量分析中，总是设法减少共沉淀的影响。

洗涤和陈化是经常采取的措施，它们虽然对减少混晶共沉淀无能为力，却可以有效地减少表面吸附和包藏引入的杂质。

改变杂质离子存在形式，降低沉淀速度，或采用均相沉淀，都是经常采取的措施，如这些方法不能奏效，还可采取再沉淀的方法。

4共沉淀分离法共沉淀分离法是富集痕量组分的有效方法之一，是利用溶液中主沉淀物（称为载体）析出时将共存的某些微量组分载带下来而得到分离的方法。

例如,在痕量Ra2+存在下将硫酸钡沉淀时,几乎可载带下来所有的Ra2+；

当氯化银沉淀时，可将溶液中极微量的金收集起来，予以富集。

6.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）

可以：

（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；

（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；

（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；

也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

7.重量分析（gravimetricanalysis）

化学分析中的一种定量测定方法，指以质量为测量值的分析方法。

将被测组分与其他分离，称重计算含量。

精确到0.1-0.2%，对低含量组分测定误差较大，尽量避免用，又称重量法。

gravimetricanalysis沉淀法、气化法、电解法例如欲测定一种水溶液试样中的某离子含量，可在适当条件下将其中欲测的离子转变为溶解度极小的物质而定量析出，再经过滤、洗涤、干燥或灼烧成为有一定组成的物质，冷至室温后称重，即可定量地测定该离子的含量。

8.表面吸附

物理吸附和化学吸附，通过分子间引力（即范德华力）吸附称为物理吸附；

化学作用，生成化学键为化学吸附。

离子交换实际上也是一种吸附。

吸附过程是非均相过程，一相为流体混合物，一相为固体吸附剂。

气体分子从气相吸附到固体表面，其分子的自由能会降低，与未被吸附前相比，其分子的熵也是降低的，据热力学定律：

△G=△H-T△S。

固体表面有吸附水中溶解及胶体物质的能力，比表面积很大的活性炭等具有很高的吸附能力，可用作吸附剂。

吸附可分为物理吸附和化学吸附，物理吸附和化学吸附并非不相容的，而且随着条件的变化可以相伴发生，但在一个系统中，可能某一种吸附是主要的。

9.翻译后修饰（Post-translationalmodification，PTM）是指蛋白质在翻译后的化学修饰。

胺基酸的翻译后修饰会附在蛋白质其他的生物化学官能团（如醋酸盐、磷酸盐、不同的脂类及碳水化合物）、改变胺基酸的化学性质，或是造成结构的改变（如建立双硫键），来扩阔蛋白质的功能。

　　再者，酶可以从蛋白质的N末端移除氨基酸，或从中间将肽链剪开。

举例来说，胰岛素是肽的激素，它会在建立双硫键后被剪开两次，并在链的中间移走多肽前体，而形成的蛋白质包含了两条以双硫键连接的多肽链。

　　其他修饰，就像磷酸化，是控制蛋白质活动机制的一部份。

蛋白质活动可以是令酶活性化或钝化。

翻译后修饰包括以下加入官能团的反应：

　　乙酰化——通常于蛋白质的N末端加入乙酰。

　　烷基化——加入如甲基或乙基等烷基。

　　甲基化——烷基化中常见的一种，在赖氨酸、精氨酸等的侧链氨基上加入甲基。

　　生物素化——用生物素附加物令保存的赖氨酸酰化。

　　谷氨酸化——在谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。

　　甘氨酸化——在一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。

　　糖化——将糖基加入天冬酰胺、羟离氨酸、丝氨酸或苏氨酸，形成糖蛋白。

　　异戊二烯化——加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。

　　硫辛酸化——附着硫辛酸的功能性。

　　磷酸泛酰巯基乙胺基化——像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合成中，从乙酰辅酶A加入4'

磷酸泛酰巯基乙胺基。

　　磷酸化——加入磷酸根至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸。

　　硫酸化——将硫酸根加入至酪氨酸。

硒化C末端酰胺化2加入其他蛋白质或肽编辑　　干扰素激活基因化——与干扰素激活基因15（ISG15）蛋白质建立共价键。

小泛素相关修饰化——与小泛素相关修饰子蛋白建立共价键。

泛素化——与泛素建立共价键。

3改变氨基酸的化学性质编辑　　瓜氨化——将精氨酸转为瓜氨酸。

脱氨化——将谷氨酰胺转为谷氨酸或将天冬酰胺转为天冬氨酸。

结构改变双硫键——与两个半胱氨酸的氨基酸建立共价键。

分解蛋白质——将蛋白质的肽键剪开。

10.亲和色谱法（affinitychromatography），将相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。

例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。

可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。

或用于对作用进行研究。

11.蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot。

它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实特异的相互验方法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋白免疫印迹（WesternBlot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗