规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象doc.docx
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规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象doc
第
37卷
分析化学
（FENXIHUAXUE） 研究报告
第
7期
2009年
7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry950～954
研究报告
规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象
卢庄
1,2 赵丽艳
2 张养军
2 蔡耘
21（北京理工大学生命科学与技术学院,北京100081）
2（蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所,北京102206）
_C）残基起始的肽段会发生氨基
端的环化修饰,且修饰反应不完全,在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在,并且环化修饰后的肽段
摘 要 对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基的一种现象
初步研究结果显示,很多以谷氨酰胺（Q）或氨乙酰化修饰的半胱氨酸（CAM
邓玉林
1 张玉奎
1 钱小红
31,2
—
———蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的
的反相色谱保留时间发生延迟。
在数据库检索时添加环化修饰
可以提高蛋白质的鉴定成功率。
本研究结果
为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考。
关键词 肽段氨基端
环化
规模化
蛋白质鉴定
1 引 言
细胞或组织内存在的全部蛋白质的定性和定量分析是蛋白质组学研究的主要内容
[1]。
为了从细
胞中鉴定目标蛋白质
候选蛋白质常用串联质谱
（MS/MS）法
[2,3]结合生物信息学的数据库检索进行分
析。
样品中的蛋白质通常先被胰蛋白酶消化成较小的肽段
然后经反相色谱分离进入质谱
;肽段经离子
化、碎裂后
产生用于鉴定的特征的
MS/MS数据
;通过在理论序列数据库中搜索
MS/MS谱图来寻找最
佳匹配的肽段
从而鉴定样本蛋白质。
然而
在实际的蛋白质鉴定中
通常只有或少于
10%的
MS/MS
谱图能够有效地鉴定出蛋白质
而大量的图谱都不能被解析
[4]。
MS/MS数据没有得到可靠的鉴定结果
除了谱图质量差
还有一个原因就是匹配不好。
很多碎片
信息很丰富的
MS/MS谱图在检索时的得分也很低
其原因是可能此肽段在数据库中不存在、或某些蛋
白质本身存在
但人工处理过程中引入的各种氨基酸残基的多种修饰影响其鉴定。
蛋白质修饰的多样
性和不均一性造成检索时实验值与理论值不相匹配
进而影响其质谱数据的正确解析。
目前
肽段鉴定
时常用的添加残基修饰有甲硫氨酸
（Met）的氧化和半胱氨酸
（Cys）的氨乙酰化
而对其它修饰研究很
少。
文献报道
以谷氨酰胺
（Q）、谷氨酸
（E）或氨乙酰化修饰的半胱氨酸
（CAM_C）残基起始的肽段
在
样品处理
[10]或者自发
[11]等状况下都会发生氨基端的环化修饰。
这些发生了环化修饰的肽段由于质量
数的偏移
在数据库检索时经常不能被正确鉴定。
为了给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息
得到更可靠的鉴定结果
本实验对蛋白质酶切肽段的端肽环化修饰现象进行了初步研究。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
毛细管高效液相色谱
2电喷雾
2线性离子阱质谱仪
（CapLC2ESI2LTQ2MS,ThermoFinnigan公司
）;安捷
伦
1100毛细管色谱系统
包括自动上样器
上样泵
（含十通阀
）和二元洗脱泵
（Agillent公司
）;4800Pro2
teomicsAnalyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪
（MALDI2TOF2TOFMS,美国
ABI公司
）;
电热恒温水浴箱
（北京医疗设备厂
）;BP211d分析天平
（瑞士
Sartorius公司
）。
2008208229收稿
;2008212218接受
本文系国家自然科学基金
（Nos.20635010,20505018,20735005）和国家重点基础研究计划
（No.2007CB914104）资助项目
E2mail:
qianxh@nic.bmi.ac.cn
.1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.
第
7期卢庄等
:
规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象
所有标准蛋白均购自
Sigma公司
;碘乙酰氨
（IAA）和甲酸
（FA）购自比利时
ACROS公司
;乙腈
（HPLC级
美国
J.T.Baker公司
）;胰蛋白酶
（Trypsin,测序级
）和二硫苏糖醇
（DTT）购自美国
Promega公
司
;0.45μm滤膜有机相微孔过滤膜
（天津津腾公司
）;超纯水由
Millipore2QA10型纯水系统
（美国
Mil2
lipore公司
）制备
其它试剂均为国产分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 蛋白质样品的处理 按照目前蛋白质组研究中经典的蛋白质变性、还原、烷基化的处理步骤处
IAA溶液在室温下置于暗处反应1h。
然后
稀释样品至其中尿素浓度<1mol/L后,按照胰蛋白酶与蛋白质质量比1∶
表1 不同比例的10种标准蛋白质混合物的配制
名称
Proteinname
理蛋白质样品
[5],操作如下
:
牛血清白蛋白
（BSA）及按照不同比例混合的
10种蛋白质混合物
（如表
1）,
分别溶于含
8mol/L尿素的
50mmol/LNH4HCO3缓冲液
（pH8.0）中
各加入终浓度
10mmol/L的
DTT
溶液
在
37℃水浴中反应
4h,再加入终浓度
25mmol/L的
Table1 Proteinmixturecontainingdifferentamountsof10differentstandardproteins
终浓度
50加入胰蛋白酶
37℃孵育
12～18h,微波加热中止酶切反应。
物种
SwissProt.号
ConcentrationTaxonomySwissProtnumber
（μmol/L）
α2乳清蛋白
α2Lactalbuminβ2酪蛋白
β2Casein
牛奶
Milk
牛奶
Milk
P00711
P02666
7.0
4.2
肌红蛋白
Myoglobin马心肌
HorseskeletalmuscleP680825.9
细胞色素
CCytochromeC牛心
BovineheartP628948.6
溶菌酶
Lysozyme鸡蛋清
ChickeneggwhiteP006987.0
β2乳球蛋白
β2Lactoglobulin牛奶
MilkP027545.5
卵清白蛋白
Ovalbumin鸡蛋
ChickeneggP010122.3
核糖核酸酶
ARibonucleaseA牛胰脏
BovinepancreaseP618236.1
人白蛋白
Humanalbumin人
HumanP027681.5
胎球蛋白
Fetuin牛
BovineP127632.8
2.2.2 RPLC2LTQ反相色谱条件 毛细管液相色谱仪所用毛细管色谱柱为
PicoFritTMBioBasic2C18反
相柱
（100mm×75μmi.d.,5μm,ThermoHypersil公司
）。
色谱洗脱采用二元泵高压混合的梯度洗
脱方式。
洗脱组分经过
ESI离子源直接进入质谱进行分析。
流动相
:
A为
0.1%FA280%水溶液
）,
B为
0.1%FA280%ACN溶液。
洗脱条件
:
2%～40%B,90min;40%～100%B,15min,然后以
100%A溶液平衡色谱柱
30min。
流速为
200nL/min;进样体积为
20μL。
2.2.3 RPLC2LTQ质谱分析条件 质谱仪为电喷雾
2线性离子阱质谱仪
（LTQMS）。
雾化
N2气流速
12L/min;碰撞气为高纯氩气
（99.999%）;喷雾电压
（sprayvoltage）3.2kV;毛细管温度
160℃;毛细
管电压
2.8kV。
数据依赖采集条件
:
质谱分析采用一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式。
利用动
态排除功能
设置排除时间为
0.5min。
二级串联质谱母离子窗口为
4Da,归一化碰撞能量为
35%;质
谱的一级全扫描质荷比范围是
m/z400～4000。
本实验所用
[M+H]+均为单同位素峰质量数。
2.2.4 数据检索参数设置 质谱采集的原始文件首先通过
BioWorks3.2软件转换为
dta文件
然后使
用软件程序
merge.pl将
dta文件合并成
mgf文件
使用
Mascot（版本
2.1）检索。
设定肽段序列氨基酸可
变修饰为甲硫氨酸氧化
（M+15.99Da）,设置半胱氨酸的氨乙酰化修饰
（C+57.02Da）为固定修饰
;第
二次检索时增加肽段氨基末端残基可变修饰
:
氨基末端
Q/E/CAM_C的环化
（Q217.03Da,E218.01Da,
CAM_C217.03Da）修饰。
设定蛋白酶为胰蛋白酶
酶切方式为全酶切
最大漏切位点
2个
一级母离子
误差
1.5Da,二级碎片离子误差
0.8Da。
检索蛋白质数据库为自建标准蛋白质数据库。
检索肽段可靠
度设置为
95%。
3 结果与讨论
3.1 BSA胰蛋白酶酶切肽段混合物中的肽段环化修饰现象
不考虑漏切位点时
BSA胰酶酶切肽段中
>500Da、并以
Q/E/CAM_C残基起始的肽段分别有
3、5
.1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.
分析化学
第
37卷
和
4个。
质谱分析的结果显示
这
12个肽段中的
8个都发生了肽段氨基端环化修饰
鉴定结果如表
2。
其中
原型检索设置的修饰为固定修饰
:
半胱氨酸的氨乙酰化
;草药可变修饰
:
甲硫氨酸氧化。
环化检索设
置的修饰为固定修饰
:
半胱氨酸的氨乙酰化
;可变修饰
:
甲硫氨酸氧化和氨基末端
Q/E/CAM_C的环化。
表
2 BSA中发生环化修饰的肽段
Table2 T
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