细胞增殖实验_精品文档Word下载.docx
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MTT在标准的细胞培养基中是不溶的,而且其生成的甲臜晶体需要溶解在DMSO或者异丙醇中。
因此,MTT主要作为终点检测方法。
其他三种盐与AlamarBlue一样,都是可溶且无毒。
它们可以作为连续监控手段来跟踪细胞增殖的动态改变。
其中XTT的效率较低,需要添加额外的因子;
WST1更灵敏有效,与其他盐相比能够更快显色;
AlamarBlue的灵敏度也很高,只要微孔板的孔中有100个细胞就能够检测到。
四唑盐和AlamarBlue氧化还原染料能够用于多种仪器和高通量研究,非常方便。
它们适用的检测仪器包括:
标准分光光度计、荧光分光光度计和酶标仪等。
3.活细胞数量
最直接的增殖指标是活细胞数量的变化。
但细胞直接计数法操作繁琐费时,所需细胞量较多,不推荐使用。
4.增殖标志检测
有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增殖细胞缺乏这些抗原,因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如,在人体细胞中,Ki-67抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期和M期(增殖期)表达,而在G0期和G1期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增殖情况。
由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受肿瘤研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括:
增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB,以及磷酸化组蛋白H3等。
5.ATP检测
细胞内的ATP含量受到了严格调控,检测ATP也可以得到细胞增殖的信息。
死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。
利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础,能够提供非常灵敏的结果。
如果有ATP存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ATP浓度成正比,用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。
这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。
选择策略
怎样选择最适合的检测方法,主要依赖于使用的细胞类型和具体研究方案,还取决于实验者在细胞增殖中期望得到的信息。
假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化,可以使用四唑盐和比色法检测;
如果关注重点在于对DNA合成的改变,可以选择用BrdU或EdU标记,再通过比色法、化学发光或荧光检测进行分析;
若研究的是单个细胞,也可以用BrdU或EdU标记来检测DNA合成,将其与荧光标记的相应抗体结合,就可以通过流式细胞仪来进行流式分选。
应该注意,测定细胞增殖很多时候单一方法都是有缺陷的,四唑盐—MTT法不够精确;
最直接的指标是活细胞数量的变化,结果比较准确,但细胞直接计数法所需细胞量较多,操作繁琐费时;
而3H掺入法麻烦且不安全。
所以,建议最好用两种以上的方法进行测定,这样做主要是可以有一个用于辅助修正的数据。
EdU实验流程
一、实验原理
EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性,适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究,尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
二、材料及准备工作
试剂、耗材名称
品牌
货号
Cell-Light™EdUApollo®
567InVitroImagingKit(500T)
广州锐博
C10327-1
细胞培养板或培养皿
☆试剂盒需4˚C储存,荧光试剂请避光,勿冻存,可稳定储存一年
溶液配制
1.PBS(pH7.2~7.6)
PBS缓冲液10x
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO4·
12H2O36.151g
(OrNa2HPO414.4g
K2HPO42.4g
蒸馏水至1000mL调pH值至7.4
2.渗透剂(含0.5%TritonX-100的PBS)
3.甘氨酸溶液(2mg/mL)(去离子水配配制,现用现配)
4.细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)
多聚甲醛4g
1xPBS定容至100ml,磁力搅拌器加热搅拌,温度控制在60℃以下。
如仍不溶,滴加NaOH(1N或0.1N),调PH值至7.4。
5.1%BSA的PBS
6.甲醇
7.无水乙醇
三、操作步骤及注意事项
A流式检测
1.样本制备
1.1取对数生长期的细胞,105细胞接种于6孔板或培养皿中,培养箱中培养过夜;
1.2可以根据实验需要进行各种药物处理。
2.EdU标记
2.1用细胞培养液以1:
1000的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备适量50µ
MEdU培养基;
2.2每孔加入500µ
L50µ
MEdU培养基孵育2h。
(☆此步务必在超净台内完成)
3.细胞固定
3.1用0.25%胰酶进行消化,转至离心管,用1×
PBS吸打后,1000rpm×
5min,弃上清;
3.2用含1%BSA的PBS吸打后,1000rpm×
3.34%多聚甲醛的PBS固定15min,1000rpm×
3.4用含1%BSA的PBS吸打后,1000rpm×
3.5300µ
LPBS吹散细胞,加入700µ
L无水乙醇(制成70%乙醇PBS液),边加边震荡混匀,4℃固定24h以上;
3.61000rpm×
5min,弃上清。
4.EdU反应
4.1按下列顺序配置适量1×
Apollo®
反应液(☆现用现配,30分钟用完,以免破坏正常的反应体系):
4.2加入500µ
L的1×
Apollo®
染色反应液,重悬细胞,避光室温孵育30min,1000rpm×
5min;
4.3加入500µ
L0.5%TritonX-100的PBS吸打,1000rpm×
5min,重复2次;
4.4每孔每次加入100µ
L甲醇冲洗1次,每次5min;
PBS100µ
L脱色摇床5min。
5.染色
5.1用去离子水按100:
1稀释试剂F,制备适量1×
Hoechst33342反应液,避光保存;
5.2弃上清,加入500µ
L1×
Hoechst33342反应液,避光室温孵育30min,1000rpm×
5min;
5.3加入500µ
LPBS吸打,1000rpm×
5min,重复2次,洗脱Hoechst33342反应液。
6.流式分析
6.11000rpm×
5min收集细胞,300µ
LPBS吹散细胞,自备300目尼龙滤膜过滤(若吹打成单细胞悬液,可不过网);
转至流式管进行流式细胞仪分析,荧光通道依据实验仪器而设定。
B荧光显微镜检测
1.1取对数生长期的细胞,4×
103~1×
105细胞接种于96孔板中(☆细胞接种密度,没有严格要求,只要不影响显微镜下观察即可),培养箱中培养过夜;
2.EdU标记细胞
2.1用细胞培养液以1:
1000的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备适量50µ
2.2每孔加入100µ
(☆此步务必在超净台内完成);
2.3弃培养液,100µ
LPBS清洗细胞2次,脱色摇床上,每次5min。
3.细胞固定化
3.1每孔加入100µ
L4%多聚甲醛的PBS,室温脱色摇床孵育30min;
3.22mg/mL甘氨酸脱色摇床孵育5min;
(☆可在多聚甲醛固定时配置,现用现配。
目的:
中和多聚甲醛)
3.3每孔加入100µ
LPBS脱色摇床孵育每次5min;
3.4每孔加入100µ
L0.5%TritonX-100的PBS,脱色摇床孵育10min;
3.5每孔加入100µ
LPBS脱色摇床孵育1次,10min。
4.2每孔加入100µ
染色反应液,避光,室温脱色摇床孵育30min;
4.3每孔每次加入100µ
L渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育2次,每次10min;
PBS100µ
5.1用去离子水按100:
5.2每孔加入100µ
Hoechst33342反应液,避光,室温脱色摇床孵育30min;
5.3每孔每次加入100µ
LPBS脱色摇床孵育2次,每次5min,洗脱Hoechst33342反应液。
6.图像获取及分析
6.1建议染色完成后,立即进行观测,因易淬灭,曝光时间建议<30ms;
如果条件限制,请避光4℃湿润保存待测,但不要超过3天。
☆特别注意
1、Apollo染色反应液一定要现用现配,按顺序加样,小心称量试剂E,注意避光。
试剂E易氧化,用毕请立即盖紧瓶盖。
若发现试剂E粉末变黄,极可能是发生了氧化失效。
2、EdU的使用浓度,用50µ
M的较多,可以在10-50µ
M间选择合适条件。
3、EdU荧光极易淬灭,请染色后立即送检或镜下观察。
附:
EdU与BrdU实验步骤比较
EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,