小鼠SOIX基因的重组等实验设计论文Word格式.docx

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它除了具有pGEM®

-T载体系统（Cat.#A3600,A3610）所有的优势外，在插入位点两侧分别有EcoRI和NotI酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。

pGEM®

-TEasy载体系统II除了pGEM®

-TEasy载体系统I所有成分外，还包括JM109感受态细胞。

特点

●灵活：

-TEasy载体多克隆位点两侧分别有BstZI,EcoRI和NotI酶切位点，便于通过选择单酶切释放插入的DNA。

●快速连接：

使用2X快速连接缓冲液（2XRapidLigationBuffer）可以使连接反应在室温下1小时内完成。

●.蓝/白筛选：

载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子，分别位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内多克隆位点的两侧。

α-肽的插入失活允许在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆。

●.f1复制起始位点：

可用于制备单链DNA。

（四）DNAMAN

4.

至此确定引物分别为：

上游引物P1：

5’—TAAGCTTATGFACAGCATGATGATGGAG一3’，（含ApaI酶切位点，GGGCCC）

下游引物P2：

5’一GGAATFCCTAGATGTGCGTCAGGGGCAC一3’（含SphI酶切位点，GCATGC）

引物可以找公司合成。

2、具体实验步骤

（1）总体实验流程图

Trizol法提取小鼠目的基因mRAN

RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认

感受态细胞的制备

质粒DNA的提取及浓度测定

重组蛋白表达及目的蛋白的免疫印迹鉴定

图1实验设计流程图

（2）目的基因提取

1.实验前准备

材料：

孕育第8天的小鼠

设备：

研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

试剂：

（1）无RNA酶灭菌水：

用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

（2）75%乙醇：

用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

（3）1×

层析柱加样缓冲液；

20mmol/LTris·

Cl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。

（4）洗脱缓冲液：

10mmol/LTris·

Cl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。

2.操作步骤

（1）小鼠总RNA的提取

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。

RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

孕第8天的小鼠用断颈法处死后在无菌条件下取其胚胎组织。

1　将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2　研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3　取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4　弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5　小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。

然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]

●整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

●加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（2）小鼠mRNA的提取

由于mRNA末端含有多poly（A）+，当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

1　用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo（dT）纤维素。

2　将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3　用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

4　将中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

5　测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

6　测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

7　加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2），2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

8　4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

9　小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

10　用少量水溶解RNA液，即可用于逆转录合成cDNA（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

●mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

●oligo（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。

每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床

（三）RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认

实验步骤

（二）所得的目的基因的总mRAND的cDNA，和实验前已经查询好的两种引物。

仪器：

冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、移液器、灭菌枪头、1.5mL灭菌离心管、0.5mL灭菌离心管、0.2mL灭菌PCR管、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。

1　RNA制备所需的试剂和溶液（见实验二）。

2　逆转录酶及其缓冲液，直接购于公司。

3　OligodT（16）：

经公司合成的干粉溶于灭菌的重蒸水中，配成10μmol/L，–20℃冻存。

4　2.5mmol/LdNTP

5　TaqDNA聚合酶及其缓冲液

6　10×

TAE电泳缓冲液：

1L含48.4gTris，11.4mL冰乙酸，7.4gNa2EDTA

7　DNA上样缓冲液：

50%甘油，0.25%溴酚兰，4℃储存或-20℃冻存

8　溴化乙锭：

配制成10mg/mL母液，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可

9　琼脂糖、DNA分子标准、灭菌的重蒸水

2.具体实验步骤

（1）总RNA的浓度测定

取出部分所提取的总RNA（体积视比色皿的大小而定），用去离子水稀释200倍，测定OD260、OD280。

如果OD260/OD280大于1.8，则认为所提取的RNA比较纯。

OD260=1相当于RNA的浓度为40μg/mL，计算总RNA的浓度。

（2）提取出的总RNA经普通琼脂糖电泳检测，通过观察总RNA的18S、28S特征条带鉴定总RNA的质量。

（3）取高质量的总RNA进行逆转录。

反应在0.5mL灭菌离心管中进行，10μl逆转录体系包括：

　　　　　　DEPC水1.5μL

　　　　　　Rnase抑制剂0.5μL

　　　　　　总RNA4μL（总量1μg）

　　　　　　oligodT（16）（10μmol/L）0.5μL

　　　　　　dNTP（10mM）1μL

　　　　　　5×

逆转录缓冲液2μL

　　　　　　逆转录酶0.5μL

在加入后三种成分前，混合物先在65℃加热5min后，迅速放置冰上，使RNA充分变性并和引物充分结合。

加入逆转录酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。

酶从冰箱取出后放置在冰上，使用完毕，应立即放回冰箱。

（4）在逆转录酶指定的温度下（一般为42℃左右）进行逆转录反应，反应时间一般为90min。

反应完毕后，70℃下10min，对酶进行灭活。

反应产物于–20℃冻存。

（5）以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。

总体积为50uL，在0.2mL灭菌的PCR管中依次加入：

　　　　灭菌的重蒸水37.5µ

L

　　10×

Taqbuffer5µ

　　2.5mmol／LdNTP2µ

　　　P1（10μmol／L）2µ

　　　　P2（10μmol／L）2µ

　　cDNA1µ

　　　　　Taq酶0.5µ

加入Taq酶后，枪头在反应混合液中反复吸吐几下，使得酶能够完全加入到反应体系中。

（6）将上述PCR管放入PCR仪中，设计程序：

94℃预变性3min，然后将下列三个步骤进行35个循环：

94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，最后于72℃下保温10min。

（7）取10μLPCR产物，用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

（8）经电泳鉴定大小正确后，可继续交送公司测序。

将测序的序列与NCBI上的序列进行比较，确定是否为小鼠SIOX基因。

（四）感受态细胞的制备

　　用物理或者化学的方法处理细菌细胞，能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态，即感受态。

制备感受态的方法和多，如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。

转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程，所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ）。

CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经热激处理后，菌体细胞膜通透性发生改变，从而吸收DNA复合物。

CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进，使不同菌株的转化效率大大提高。

本实验以大肠杆菌JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。

由于pBS质粒（图1）带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可通过Amp抗性来筛选转化子。

如受体细胞没有转入pBS质粒（含有pGEM®

-TEasy载体），则在含Amp的培养基上不能生长。

能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS质粒。

转化子繁殖后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

1．实验前准备

材料

大肠杆菌JM109菌株（菌液中加入50％甘油，冻存－70℃，可供下次使用）、pB