1、它除了具有pGEM-T 载体系统(Cat.# A3600, A3610) 所有的优势外,在插入位点两侧分别有EcoRI 和NotI 酶切位点,便于通过选择单酶切释放插入的DNA。pGEM-T Easy 载体系统II 除了pGEM -T Easy载体系统I 所有成分外,还包括JM109 感受态细胞。特点 灵活:-T Easy 载体多克隆位点两侧分别有BstZI, EcoRI和NotI 酶切位点,便于通过选择单酶切释放插入的DNA。 快速连接:使用2X 快速连接缓冲液(2X Rapid Ligation Buffer)可以使连接反应在室温下1 小时内完成。 .蓝/ 白筛选:载体包含有T7 和SP6
2、 RNA 聚合酶启动子,分别位于 - 半乳糖苷酶的 - 肽编码区内多克隆位点的两侧。 - 肽的插入失活允许在指示培养基上用颜色直接筛选重组克隆。 .f1 复制起始位点:可用于制备单链DNA。(四)DNAMAN4.至此确定引物分别为:上游引物P1:5TAAGCTTATGFACAGCATGATGATGGAG一3,(含ApaI酶切位点,GGGCCC)下游引物P2:5一GGAATFCCTAGATGTGCGTCAGGGGCAC一3(含SphI酶切位点,GCATGC)引物可以找公司合成。2、具体实验步骤(1)总体实验流程图Trizol法提取小鼠目的基因mRANRT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认感受态
3、细胞的制备质粒DNA的提取及浓度测定重组蛋白表达及目的蛋白的免疫印迹鉴定图1 实验设计流程图(2)目的基因提取1.实验前准备材料:孕育第8天的小鼠设备:研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。试剂:(1)无RNA酶灭菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180 2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。(2)75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。(3)1层析柱加样缓冲液;20mmol/L TrisCl(pH7.6),0.5mol/L NaCl,1mmo
4、l/L EDTA(pH8.0),0.1% SDS。(4)洗脱缓冲液:10mmol/L TrisCl (pH7.6),1mmol/L EDTA (pH8.0),0.05% SDS。2.操作步骤 (1)小鼠总RNA的提取Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。孕第8天的小鼠用断颈法处死后在无菌条件下取其胚胎组织。1将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol
5、液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。3取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。4弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4下7500g离心5分钟。5小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮
6、存于70%乙醇并保存于-70。注意 整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周,-20保存一年。(2)小鼠mRNA的提取由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT) 纤维素柱,可得到较纯的mRNA。1用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。2将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处
7、理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。4将中提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。5测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。7加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2), 2.5倍体积的冰冷乙醇, 混匀,
8、-2030分钟。84下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗 涤沉淀,4下12000g离心5分钟。9小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。10用少量水溶解RNA液,即可用于逆转录合成cDNA(或保存在70%乙醇中并贮存于-70)。 mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。 oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床(三)RT-PCR扩增目的基因和基因测序与确认实验步骤(二)所得的目的基因的总mRAN
9、D的cDNA,和实验前已经查询好的两种引物。仪器:冷冻台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、 紫外检测仪、移液器、灭菌枪头、1.5 mL灭菌离心管、0.5 mL灭菌离心管、0.2 mL灭菌 PCR管、灭菌剪刀、灭菌大镊子、液氮、碎冰。1RNA制备所需的试剂和溶液(见实验二)。2逆转录酶及其缓冲液,直接购于公司。3OligodT(16):经公司合成的干粉溶于灭菌的重蒸水中,配成10 mol/L,20冻存。42.5 mmol/L dNTP5Taq DNA聚合酶及其缓冲液610TAE电泳缓冲液:1 L含48.4 g Tris,11.4 mL 冰乙酸,7.4 g Na2E
10、DTA7DNA上样缓冲液:50%甘油,0.25%溴酚兰,4储存或-20冻存8溴化乙锭:配制成10 mg/mL母液,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可9琼脂糖、DNA分子标准、灭菌的重蒸水2.具体实验步骤(1)总RNA的浓度测定取出部分所提取的总RNA(体积视比色皿的大小而定),用去离子水稀释200倍,测定OD260、OD280。如果OD260 / OD280 大于1.8,则认为所提取的RNA比较纯。OD260=1相当于RNA的浓度为40g/mL,计算总RNA的浓度。(2)提取出的总RNA经普通琼脂糖电泳检测,通过观察总RNA的18S、28S特征条带鉴定总RNA的质量。(3)取高质量的总RNA进
11、行逆转录。反应在0.5 mL灭菌离心管中进行,10l逆转录体系包括:DEPC水 1.5 LRnase抑制剂 0.5 L总RNA 4 L(总量1g )oligo dT(16)(10mol/L) 0.5 LdNTP (10 mM) 1 L5逆转录缓冲液 2 L 逆转录酶 0.5 L在加入后三种成分前,混合物先在65加热5 min后,迅速放置冰上,使RNA充分变性并和引物充分结合。加入逆转录酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。(4) 在逆转录酶指定的温度下(一般为42左右)进行逆转录反应,反应时间一般为90 min
12、。反应完毕后,70下10 min,对酶进行灭活。反应产物于20冻存。(5)以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。总体积为50 uL,在0.2 mL灭菌的PCR管中依次加入: 灭菌的重蒸水 37.5 L 10Taq buffer 5 2.5 mmolL dNTP 2 P1(10 molL) 2 P2(10 molL) 2 cDNA 1 Taq酶 0.5 加入Taq酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。(6)将上述PCR管放入PCR仪中,设计程序:94预变性3 min,然后将下列三个步骤进行35个循环:94变性1 min,55退火1 min,72延伸1 mi
13、n,最后于72下保温10 min。(7)取10 L PCR产物,用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。(8)经电泳鉴定大小正确后,可继续交送公司测序。将测序的序列与NCBI上的序列进行比较,确定是否为小鼠SIOX基因。(四)感受态细胞的制备用物理或者化学的方法处理细菌细胞,能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态,即感受态。制备感受态的方法和多,如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程,所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M)。CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0的CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球形,外源DN
14、A与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经热激处理后,菌体细胞膜通透性发生改变,从而吸收DNA复合物。CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进,使不同菌株的转化效率大大提高。本实验以大肠杆菌JM109菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒(图1)带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS质粒(含有pGEM-T Easy 载体),则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pBS质粒。转化子繁殖后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。1实验前准备材料大肠杆菌JM109菌株(菌液中加入50甘油,冻存70,可供下次使用)、pB
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