免疫组化方法中关键环节及其原理解述Word格式文档下载.docx
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4、抗原修复:
由于组织中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联与醛基的封闭作用,从而失去抗原性;
通过抗原修复,使得细胞抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。
修复液也分为假如干种〔具体的可以查阅相关资料,大量的:
中性的、高pH的等〕。
我们实验室一般用微波修复中火6min*4次,效果不错。
注意微波修复后自然冷却30min左右〔只要你觉得修复液的温度达室温即可〕。
5、细胞通透:
目的是使抗体能够充分地进入胞进展结合反响。
一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。
如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体与大分子结构的物质进入胞浆和胞核,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞与相应抗原结合。
在免疫组织化学〔>
10um厚切片〕和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂,在膜上打孔。
6、灭活源性过氧化物酶和生物素:
在传统的ABC法和SP法中,免疫组化反响结果容易收到源性过氧化物酶和生物素的干扰,必须用过氧化氢和卵白素等进展灭活。
灭活源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点,可以10min左右,而0。
3%过氧化氢如此可以适当延长封闭时间,一般10~30min;
用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用,过氧化氢孵育时间过长易引起脱片;
现用现配,配好后4度避光保存。
不过,现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒〞防止源性生物素的干扰,推荐使用。
7、血清封闭:
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续结果的假阳性;
封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反响的位点发生结合;
也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。
一般室温或37度10-30min。
8、一抗和二抗浓度和孵育时间:
一抗孵育条件在免疫组化反响中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。
一抗孵育温度有几种:
4度、室温、37度,其中4度效果最优;
孵育时间:
这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
具体条件还要摸索。
二抗孵育条件:
二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,假如是浓缩液还要摸索浓度。
但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
9、抗体稀释液:
其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可,但专用的抗体稀释液中除PBS成份外,还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份,对抗体的屡次回收利用较好。
正因为这种原因,我一直用国产的专用抗体稀释液,一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果〔提示可能一抗没有结合〕,最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后,发现是新抗体稀释液的PH值偏酸,而使抗原抗体反响不佳,终而出现假阴性结果。
10、切片清洗〔浸洗、冲洗和漂洗〕:
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗〔延长时间和增屡次数〕尤为重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
注意:
〔1〕单独冲洗,防止交叉反响造成污染。
〔2〕温柔冲洗,防止切片的脱落。
我喜欢用浸洗方式;
〔3〕冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。
〔4〕PBS的PH和离子强度的使用和要求。
这方面我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄〔未见特.6浓度是0.01M。
〔中性与弱硷性条件〔PH7-8〕有利于免疫复合物的形成,而酸性条件如此有利于分解;
低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度如此有利于分解〕
11、DAB显色:
背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。
DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗;
DAB显色时间很短〔如几秒或几十秒〕就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;
此外,假如很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;
DAB显色时间很长〔如超过十几分钟〕才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短〔最好一抗4度过夜〕;
另一方面就是封闭时间过长。
12、复染:
目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进展定位,经常用苏木素复染〔胞核染料〕。
注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况,一般数秒-数分钟,胞浆蛋白可以适当时间长一点,而胞核蛋白如此要短。
不过这个如果染色不理想可以补救的。
即:
染色深如此分化时间稍长些即可;
染色浅如此再置于苏木素中染色即可。
盐酸酒精是分化,氨水是返兰。
作用不同。
片子复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒〔一定动作要快〕后拿出流水振洗,在放入氨水中返兰即可。
13、封片:
为了长期保存,我们一般用中性树胶等封片,防止产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;
当发现液体接触面在不断弥散时,如此可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。
二、免疫荧光方法中的重要环节
1、冰冻切片制备:
建议用新鲜组织,否如此组织细胞部结构破坏,易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定:
切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进展固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要与时固定和适当保存。
3、血清封闭:
为防止源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清〔与二抗来源一致〕封闭,减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min。
4、一抗孵育条件:
在免疫组化反响中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。
5、二抗孵育条件:
二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,假如是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反响。
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进展适当的离心。
6、复染:
目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进展定位。
一般常用DAPI复染。
7、封片:
为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。
防止产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;
8、切片清洗:
注意〔1〕单独冲洗,防止交叉反响造成污染。
这方面我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄〔未见特异性染色〕,建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。
9、拍照:
有条件的话最好立即拍照,假如不能与时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。
使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进展操作,不要随意改变程序;
应在暗室中进展检查;
防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;
检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;
标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱或褪色;
激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象;
所以最多不得超过2~3h;
荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。
天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。
灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。
一天中应防止数次点燃光源。
关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;
标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。
假如将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发;
使用的玻片等载体,都必须厚度均匀,无明显的自发荧光,如果使用油镜,还必须保证镜油为无荧光镜油;
电源最好装稳压器,否如此电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析与其对策
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的根底和前提。
由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:
无色片〔即无阳性信号〕和“杂音〞染色片〔有阳性信号〕。
一、无色片
染色完毕后,切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比拟常见的现象,出现这种现象,有两种可能:
1、真阴性结果:
整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。
2、假阴性结果:
即此阴性结果不是真实的反映。
假阴性结果又可分为两种情况:
〔1〕切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切片进展染色是获得正确结果的前提。
由此明确:
制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。
〔2〕染色过程中的某一或某些环节出了问题。
比如,组织未进展抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;
或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;
或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。
也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢。
为了防止这种简单的错误,有一种简单的方法:
在三抗孵育完毕时,将切片上的三抗甩在一白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。
如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反响,问题肯定在三抗或DAB的配制过程。
这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。
解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照〞。
如果阳性对照有