基于硅杂罗丹明近红外荧光探针的研究进展文档格式.docx

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一、引言

由于荧光染料其自身所具有的灵敏度高、检测性好和发光效率高等多项优点，荧光染料在医药学、化学生物学等相关学科中作为特异性识别生物体内对应物质的运动和变化的优秀研究工具，在其中起到了至关重要的作用，荧光成像技术也借此成为高效率分辨活细胞中生物事件和物质运动的最强有力的技术之一[1]。

Tsien等于1990年合成了一种新型的Ca2+荧光探针，自此为荧光探针技术的新局面打开了大门，从上世纪末至今为止已经研制出了许许多多的荧光探针，这其中很大一部分探针为生物学和医学研究做出了巨大的贡献[2,3]。

然而，荧光探针也不是万能的，有许多生物体及其组织细胞在可见光的激发下其自身会发射荧光，背景辐射严重的情况下还会干扰生物样品活细胞的荧光检测和造影[4,5]。

因此,近几年来，随着荧光成像技术作为人们研究生物体内活细胞中的高效研究工具被广泛运用，人们产生了着手设计既满足研究生化过程中的需求，又具有近红外荧光性质的荧光染料的想法,这样一来便既能满足生物荧光成像的要求,同时又尽可能保留了传统染料的诸多优点[6]。

Qian等人于2008年合成了世界上第一个硅基取代氧杂蒽染料（TMDHS），从而拉开了硅原子取代罗丹明染料发展的序幕[7]。

在此基础上形成的各式各样的硅杂罗丹明染料探针凭借着它们优良的光化学性质,迅速吸引了各界的目光，一跃成为了生物荧光成像的焦点[8,9]。

作为传统荧光染料，罗丹明是一种可以通过细胞膜的选择性染色活细胞的荧光染料。

而通过将罗丹明分子中Si原子替代O原子，则可以在保留了主体传统结构优势的基础上进而优化，得到一类新型的探针分子。

它们能够较为迅速的穿过细胞膜，而且毒害性对细胞来说相对较小，除此之外这类染料分子在保持了O型荧光染料优秀的光学性质的同时，自身光谱还发生了明显的红移，从而更好的满足了近红外荧光检测的要求，减少了生物体样本的自身影响，使检测工作简易化，扩大了罗丹明探针的适用范围[6]。

由于绝大多数传统罗丹明的辐射都在可见光的红光区，对于组织成像等部分生物领域来说并不适用，为了能够使罗丹明类染料的检测范围更进一步向近红外光区红移，并且不损失它较高的量子效率，硅杂罗丹明探针的出现无疑是在罗丹明类探针发展史上迈出了重要的一步[6]。

硅杂罗丹明探针其在远红光区到近红外区的量子效率远比常用的花菁类染料要高的多，无疑大大扩宽了罗丹明类染料在生物组织成像方面的应用前景。

在上述提到的基础上，本文将从硅杂罗丹明这一点开始出发，接下来对硅杂罗丹明的合成与发展、构建机理、应用等方面进行综述，并于最后展望了硅杂罗丹明的应用前景和未来发展方向。

二、硅杂罗丹明的合成

硅基罗丹明染料不仅在保留了传统罗丹明类染料荧光特性的基础上使其可以在近红外光区检测，同时还利用了它的结构上的优势从而让它可以与多种原子或基团进行杂化结合来实现特异性染色。

接下来我将介绍几个过去通过不同的方法与不同原子或基团结合形成，从而来更好满足靶向需求，并且在硅杂罗丹明类染料发展史上具有显著意义的特异性荧光染料的例子。

2.1TMDHS的合成

2008年，Qian等人通过把传统荧光染料焦宁Y（PyronineY，PY）分子中第10位的O原子用二甲基硅基团来进行取代,得到了TMDHS（图2-1）[9]。

结果就是通过改变焦宁Y分子结构中的一个O原子，从而使得TMDHS的紫外吸收光谱和荧光发射光谱产生了显著的红移，大约红移了90nm左右，红移至NIR区域[9,10]。

进一步通过分析数据发现，PY分子的HOMO能级比TMDHS分子低0.14eV，而LUMO能级比TMDHS分子高0.18eV。

从而在结果上表现为，PY的λabs为522nm,λem为569nm,硅取代后的TMDHS的λabs为641nm,λem为659nm。

这约90nm的红移是由于二甲基硅基团对于氧原子的取代，从而使HOMO、LUMO能级差发生变化进而导致TMDHS分子光谱发生了显著改变[10]。

图2-1TMDHS的化学结构

2.2SiRs的合成

Nagano等人于2011年研究出了一种思路并在此基础上设计出来了一种硅杂蒽类荧光探针的合成路线[11]。

该路线的步骤是先制备关键的硅杂蒽酮中间体Si-xanthone，再进一步与含有不同取代基的苯基锂试剂发生亲核反应，然后在通过在酸性条件下的脱水，最后合成得到含有不同取代基的硅杂蒽衍生物（图2-2）[12]。

图2-2SiRs的合成

然而从图示2-2也可以看出，利用此种方法合成SiRs的步骤较为繁琐，反应条件相对来说也较为严格。

事实上，经过很多研究人员的反复实验，这种方法也被普遍认为收率不高，后处理也困难，不易作为工厂大批量生产试剂的方法[6]。

但不可否认的是这种方法也为后续硅杂罗丹明的合成提供了不错的参考与思路。

通过借鉴这种方法，具有较显著光谱位移的染料SiR600、SiR650、SiR680、SiR700和SiR720相继被成功构建出来（图2-3）[13,14]。

图2-3SiR600、SiR650、SiR680、SiR700和SiR720结构及光谱数据

2.3SiRB的合成

2014年Wang等人为了将螺环的“关-开”调控机制运用于罗丹明染料的荧光探针，合成出来了一种含有内酯螺环结构的硅基罗丹明染料SiRB[15]。

这种染料并不同于以往以Si-xanthone作为关键中间体的SiRs，而是通过把二芳基甲硅烷基醚作为关键中间体，让二芳基甲硅烷基醚与苯环上含有不同取代基的苯甲醛类化合物进行缩合，从而直接得到了不同种类的硅杂蒽衍生物SiRBs（图示2-4）[16]。

图2-4SiRB的合成方法对比

经过研究发现,这种硅基罗丹明中的内酯螺环也具备有“关-开”调控的能力,进而可以用于调控染料的荧光信号:

螺环处于关闭的内酯状态时,溶液没有颜色和荧光;

当螺环处于打开的羧酸状态时,溶液则呈现标志性的蓝色,同时伴有强烈的近红外荧光发射，可以被仪器响应检出（图2-5）[15,17]。

图2-5SiRB闭环开环结构及光谱数据

三、硅杂罗丹明探针的构建机理

对于常规的荧光探针来说，探针本身都是不具备荧光信号的,而是通过选择性地与底物结合作用后，以此来产生强烈的荧光信号,从而提高信噪比并检测[6]。

罗丹明类探针也不例外，因为作为主族元素的硅来进行取代的罗丹明与传统罗丹明结构上的类似性,所以比起其他探针来说，可以更加方便地借鉴传统罗丹明染料探针的荧光信号调控机制。

也就是说，常规构建思路就是通过借助传统罗丹明染料探针的机理，来完成基于硅元素取代的罗丹明染料的探针体系的进一步构建,从而能够尽到最大限度地发挥其近红外光谱特性,满足对于生物样品的高选择性和高灵敏度的近红外成像要求[6]。

于此同时,由于不同取代原子或基团都有其独特的电子效应和特殊性质,这些方面也会在一定程度上对探针的化学性质产生影响,然后得到适用于不同种类环境下的罗丹明染料探针，从而针对性的产生不同的识别成像效果。

3.1基于光诱导电子转移机制的荧光探针

光诱导电子转移法（PhotoinducedElectronTransfer,PET）作为一种荧光猝灭机制,它可以用来调控荧光探针的信号,是荧光探针设计中最常使用的机制之一[18,19]。

由图示6可以看出，HOMO和LUMO的差值越大，光诱导电子转移（PET）控制机制就越有效（图3-1），也就是说，当荧光团的波长越短时，光诱导电子转移的控制效果也就越好[20]。

PET过程中自由能的变化（ΔGPET）遵循Rehm-Weller方程:

ΔGPET=Eox−Ered−ΔE00−C（Eox为电子给体的氧化电位,Ered为受体染料的还原电位,∆E00为受激发染料跃迁能量,C为常数）。

当∆GPET为负值时,就会发生光诱导电子转移[21]。

由于硅基罗丹明染料具有的较低能量的LUMO轨道,可以致使Ered的明显升高,因此如果可以通过苯环修饰,控制HOMO能量,就可以获得较高的荧光量子产率[22]。

通过这种思路,有许多基于PET机制的具有近红外波长和良好荧光效应的硅杂罗丹明探针，近些年来被大量制造出来或者进行了相应理论的构建并被发表和报道。

图3-1光诱导电子转移机制示意图

比如，Koide等人发现,当苯环上引入二甲胺后,会发生PET致使荧光猝灭（ΦF<

0.001）,在此基础上他们进一步引入不同的取代胺基,设计合成了一系列对酸敏感的pH荧光探针SiR-pH（图3-2）[22]。

这些探针可以通过不同的取代胺基来实现精确调控探针Pka从而做到对不同PH环境的精确相应。

图3-2SiR-pH的结构及光谱数据

再如，Bertozzi课题组通过前期的研究工作，在其中发现了苯环上的叠氮基具有降低苯环电子密度的作用，于是他们在Nagano等于2011年研究设计的一种硅杂蒽类荧光探针的合成路线的基础上[11,12]，Bertozzi课题组进行了优化和改良，设计并合成出了一种叠氮基作为荧光淬灭基团的PET硅基罗丹明类近红外荧光探针[23]。

通过对合成的一系列具有不同取代基和不同取代位置的化合物进行光谱学性质研究，确定了PET效果最好的探针分子结构为化合物9（图3-3）；

化合物9经“click”反应后，叠氮基与炔基形成三唑结构，PET过程被破坏，荧光增强可达48倍[24]。

图3-3化合物9的click衍生物

还有，除了对经典的离子的识别响应外,基于PET机制的硅基罗丹明探针还可以用于生物小分子的近红外荧光识别成像,Kim等人合成并报道了一种基于硅基罗丹明的单线态氧（1O2）近红外荧光探针——SiR-DMA（图3-4）[25]。

探针SiR-DMA的荧光量子产率仅为0.01,当其与1O2发生反应后破坏了蒽环,生成SiR-DMEP,PET过程被有效阻断,荧光量子产率随之增长到0.17,荧光得以恢复[25]。

图3-4SiR-DMA的结构及光谱数据

3.2基于闭环-开环机理硅杂罗丹明荧光探针

2011年，Koide等人在早期研究成果的基础上，在硅基罗丹明分子中引入了合适的亲核基团硫醇，基于“闭环-开环”调控机理设计合成出了一种次氯酸（HClO）的近红外荧光探针——MMSiR（图3-5），并在之后进一步研发了水溶性更好的wsMMSiR[11,13]。

图3-5MMSiR的结构及识别HClO的光谱数据

随后，Wang等人借用传统罗丹明探针中的设计策略，将更具广泛性的内酰胺螺环也引入到了硅基罗丹明染料中，设计合成出了Hg2+诱导的“闭环-开环”调控的反应型探针SiR-Hg（图3-6）[15]。

图3-6SiR-Hg的结构及识别Hg2+的光谱数据

3.3基于荧光共振能量转移的硅杂罗丹明荧光探针

荧光共振能量转移（FRET）是指在一定波长的光的照射下，荧光基团中的能量给体会受到激发产生荧光发射，然后通过偶极与偶极之间的相互作用进而把能量无辐射地转移给其附近处于基态的能量受体荧光基的过程[22]。

在荧光共振能量转移机理中，首先，要求能量给体的荧光发射光谱与能量受体的吸收光谱要有一定程度的重叠[35]。

其次，给体与受体的碰撞直径应该小于二者之间的距离，这样才会有可能发生给体与受体之间的非辐射能量转移，也就是长程能量转移[26]。

四、硅罗丹明探针的应用

硅罗丹明探针作为一种荧光探针，主要是应用于活体细胞或组织内的