细菌回复突变试验docWord文件下载.docx

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利用一组组氨酸或者色氨酸缺陷型试验菌株测定引起细菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的氨基酸缺陷型-原养

型回复突变的试验方法。

2.6S9

经多氯联苯（PCB混合物）或苯巴比妥钠和&

蔡黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。

3原理

鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故

在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；

大肠杆菌色氨酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色

氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。

假如有致突

变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。

某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入

经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。

4仪器和设备

培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱（—80C）或液氮生物容器、普通冰箱、天平

（精密度0.1g和0.0001g）、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿、生物安全柜等。

5培养基和试剂

5.10.5mmol/L组氨酸一0.5mmol/L色氨酸一0.5mmol/L生物素溶液

成分：

L-组氨酸（MW155）78mg

D-生物素（MW244）122mg

L-色氨酸（MW204）102mg

加蒸储水/去离子水至1000mL

配制：

将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。

贮于4c冰箱。

若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。

5.2顶层琼脂培养基

琼脂粉1.2g

氯化钠1.0g

加蒸储水/去离子水至200mL

上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

实验时，加入0.5mmol/L组氨酸一0.5mmol/L色氨酸一0.5mmol/L

生物素溶液20mLo若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸。

5.3Vogel-Bonner（V-B）培养基E

枸檬酸（C6H807H2。

）100g

磷酸氢二钾（K2HPO4）500g

磷酸氢镂钠（NaNH,HPO44H2。

）175g

硫酸镁（MgSO47H2。

）10g

先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸储水/去离子水至1000mLo于0.103MPa下高压灭菌30min。

储于4c冰箱。

5.420%葡萄糖溶液

葡萄糖200g

加少量蒸储水/去离子水加温溶解葡萄糖，再加蒸储水/去离子水至1000mLo于0.068MPa下高压灭菌20min。

储于4c冰箱。

5.5底层琼脂培养基

琼脂粉7.5g

蒸储水/去离子水480mL

V-B培养基E10mL

20%葡萄糖溶液10mL

首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。

按每皿25mL制

备平板，冷凝固化后倒置于37c培养箱中24h,备用。

5.6营养肉汤培养基

牛肉膏2.5g

胰月东5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g

加蒸储水/去离子水至500mL

将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌

30min。

5.7盐溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2）

氯化钾（KCl）61.5g

氯化镁（MgCl26H2O）40.7g

在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

5.80.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）

磷酸二氢钠（NaH2P042H2。

）2.965g

磷酸氢二钠（Na2HPO412心0）29.015g

溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。

储于4c冰箱。

5.9S9混合液

每毫升S9混合液

100"

20"

肝S9

盐溶液

灭菌蒸储水/去离子水380"

0.2mol/L磷酸盐缓冲液500"

辅酶II（NADP）4pmol

6-磷酸葡萄糖（G-6-P）5Pmol

将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液

的溶液中。

该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。

实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。

5.10菌株鉴定用和特殊用途试剂

5.10.1组氨酸-色氨酸-生物素平板

琼脂粉15g

蒸微水/去离子水934mL

（V-B）培养基E20mL

20%葡萄糖20mL

灭菌盐酸组氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL

灭菌盐酸色氨酸水溶液（0.5g/100mL）10mL

灭菌0.5mmol/L生物素溶液6mL

高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基、组氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸微水/去离子水改为944mL）o待溶液稍微冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。

5.10.2氨节青霉素平板和氨平青霉素/四环素平板

蒸储水/去离子水930mL

（V-B）盐溶液20mL

灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL

氨节青霉素溶液（8mg/mL于0.02mol/L3.15mL

NaOH中）四环素溶液（8mg/mL于0.02mol/LHCl0.25mL

中）

琼脂和水高压灭菌20min,将无菌的葡萄糖、VB盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液，加进热的琼脂溶液中，混匀

（若试验中不使用大肠杆菌，则不添加色氨酸，同时蒸储水/去

离子水改为加940mL）o冷却至大约50C,无菌条件下加入四环素溶液和/或氨节青霉素溶液。

应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。

5.10.3营养琼脂平板

营养肉汤培养基500mL

于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板

6试验菌株及其生物学特性鉴定

6.1试验菌株

采用以下菌株作为标准组合：

鼠伤寒沙门氏菌TA1535;

鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537;

鼠伤寒沙门氏菌TA98;

鼠伤寒沙门氏菌TA100;

鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）;

6.2生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生

物特性鉴定。

菌株鉴定的判断标准，如表1所示

表1试验菌株鉴定的判断标准

菌株

组氨酸缺陷

色氨酸缺陷

脂多糖屏障缺损

氮未青霉素抗性

切除修复缺损

*

自发回变菌落参考数

四环素抗性

Ames实验室

Zeiger实验室

TA97

+

/

-

90~180

75~200

TA97a

TA98

30~50

20~50

TA100

100~200

TA102

240~320

100~400

TA1535

10~35

5~20

TA1537

3~15

WP2uvrA

WP2uvrA（pKM101）

注

“+表

示需要组氨酸

“钱

示需要色氨酸

“钱示具有■fa美变

示具有

R因子

+”表示对于鼠伤寒沙门氏菌具有

△uvrB突变，对于大肠杆菌，具

u+^

具有

pAQ1质

粒

*在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增。

对于各菌的自发回变范围,各个实验室在参考其他实验室数据的基础上应建立自己的历史对照数据库，形成适合本实验室条件的适用范

有AuvrA突

变

围。

同时，实验室背景数据应当与文献报道相符。

6.2.1组氨酸缺陷/色氨酸缺陷

原理：

组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。

色氨酸缺陷试验菌株本身不能合成色氨酸，只能在补充色氨酸的培养基上生长，而在缺乏色氨酸的培养基上，则不能生长。

鉴定方法：

将测试菌株增菌液分别于含组氨酸或者色氨酸

培养基平板和无组氨酸或者色氨酸平板上划线，于37c下培养

24h后观察结果。

结果判断：

组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在

无组氨酸平板上则不能生长；

色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生长，而在无色氨酸平板上则不能生长。

6.2.2脂多糖屏障缺损

具有深粗糙（rfa）的菌株，具表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质，如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。

吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上

划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放

置。

37c下培养24h后观察结果。

假若待测菌在滤纸条与划线交叉处由现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。

6.2.3氨节青霉素抗性

含R因子的试验菌株对氨节青霉素有抗性。

因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨节青霉素确定该质粒存在与否。

吸取待测菌株增菌液0.1mL,在氨节青霉素平

板上划线，37c下培养24h后观察结果。

结果判断；

假若测试菌在氨节青霉素平板上生长，说明该测

试菌具