浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆表达及抗体制备Word文档格式.docx

浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆表达及抗体制备Word文档格式.docx

《浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆表达及抗体制备Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆表达及抗体制备Word文档格式.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

105。

结论:

首次成功克隆并表达了pNCTC11637cagM基因，并制备了其抗体，为以后进一步研究其生物学功能以及相关疾病的检测与治疗奠定了基础。

【关键词】幽门螺杆菌；

Ⅳ型分泌系统；

cagM基因；

抗体

　　CloningandexpressioncagMgeneofHelicobacterpyloritypeⅣsecretion　systemandantibodypreparation

　　TIANShuwei,SHAOShihe,HANJun,HUANGHe,HUANGShiteng

　　（InstituteforLifeSciences;

DepartmentofMicrobiology,SchoolofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China）

　　［Abstract］Objective:

ToconstructprokaryoticexpressionvectorforexpressingcagM（HP0537）ofHelicobacterpylori（）NCTC11637ofⅣtypesecretionsystem,toanalyzeitsantigenicityandtoproduceantibodies.Methods：

PCRtechnologywasusedtoamplifycagMfromthe　genome.ThenTAcloningwasusedforsequenceanalysis.WeconstructedexpressionvectorpET28a（+）cagM,andtransformeditto　BL21.IPTGwasusedtoinduceexpression.AfterSDSPAGEforidentificationofexpressedproteinandNi2+NTAcolumnforpurification,usedsoftwareanalysisofitsantigenicity,andpreparedantibodybyimmunizationofrabbits.Atlast,ELISAwasusedtodetectpolyclonalantibodytiters.Results:

cagMgenesequencingresultsshowedthatthefulllengthwas1131bp（GenBankaccessionnumber:

GU269568）,encoding376aminoacids.ComparedwithstrainsJ99,26695andG27,itsaminoacidhomologywas98%～99%.AftertheinducedexpressionandSDSPAGEanalysis,inthe43700positionfoundanewband,andNi2+NTAcolumnpurifiedwasasingleband.Thesoftwareanalysisshowedthattheantigenicitywasstronger.Thepreparedrabbitpolyclonalantibodytiterwas1∶×

105.Conclusion:

Forthefirsttimesuccessfullyclonedandexpressedthe　NCTC11637cagMgenes,andprepareditsantibody,whichprovideafoundationforfurtherstudyitsbiologicalfunction,aswellasthedetectionandtreatmentofHelicobacterpylorirelateddiseasesresearchinthefuture.

　　［Keywords］Helicobacterpylori；

Ⅳtypesecretionsystem；

cagMgene；

antibody

　　幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,）是一种定植于人类胃黏膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，现已证实感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因［1,2］，Ⅰ型基因组中有一个约40kb的基因片段，即cag致病岛，其编码一些毒素蛋白和一个分泌装置，即Ⅳ型分泌系统，TFSS形成一个跨膜通道，通过转运相关毒素如毒力蛋白CagA参与细胞信号调节，从而导致一系列病变，如胃炎、胃溃疡和胃癌等［3,4］。

有研究发现cagM是Ⅳ型分泌系统的重要基因，对转运CagA和刺激上皮细胞产生炎症因子IL8非常重要［5,6］。

但是，关于CagM在Ⅳ型分泌系统中的作用及在幽门螺杆菌致病过程中的作用尚未见报道。

本文针对这一现状，首次克隆表达了NCTC11637cagM基因全序列，并用生物信息学方法分析了其抗原性，制备了其抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。

　　1材料和方法

　　材料

　　菌株及质粒

　　NCTC11637由中国疾病控制中心传染病预防研究所张建中教授馈赠，大肠埃希菌DH5α，BL21和pET28a（+）载体为江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存，pGEMT载体购自Promega公司。

　　试剂和仪器

　　哥伦比亚培养基、厌氧袋；

ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶BamHⅠ，XhoⅠ及T4DNA连接酶，1kbDNA标准，DL2000DNA标准参照物、蛋白质分子量标准及IPTG；

绵羊血；

胶回收试剂盒；

Ni2+NTA；

HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；

引物；

核酸紫外检测仪；

PCR仪；

电泳仪；

超低温冰箱ULT7903V；

超声破碎仪XL2020；

酶联检测仪；

凝胶成像及分析系统ChemidocXRS；

蛋白垂直电泳仪，其他试剂均为普通分析纯试剂。

　　方法

　　的培养与基因组提取

　　将NCTC11637标准菌株接种于含10%羊血的哥伦比亚平板上，37℃，微需氧培养72h，从培养基上刮取生长状态良好的菌落，用PBS洗涤3次收集细菌。

基因组提取用酚氯仿提取法，参照《分子克隆》。

　　cagM基因PCR扩增

　　根据基因库中已报道的的全基因组序列，用设计cagM引物，上游5′TAGGGATCCGAGCAGTTTGGTTCATTT3′；

下游5′CGCCTCGAGCTATTCAAAGGGATTATTC3′，并在其5′端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点和保护碱基，PCR产物全长1149bp，PCR参数：

94℃5min，94℃30s，56℃45s，72℃1min，30个循环，72℃10min。

PCR产物经%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析，拍照，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

　　目的基因TA克隆和测序

　　胶回收的PCR产物与pGEMT载体连接后，转化DH5α。

转化后的细菌涂布于含50μg/ml氨苄西林的LB平板筛选，挑菌于含氨苄西林的液体LB培养基中扩增，收集菌液，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，将鉴定正确的pGEMTcagM，送上海生工生物公司测序，将测序结果提交基因库，并获取登录号。

　　生物信息学软件分析CagM化学特征及抗原性

　　用Antheprot软件分析CagM蛋白的氨基酸组成、相对分子质量、等电点、疏水性和抗原性等。

　　重组表达质粒的构建和鉴定

　　将构建好的pGEMTcagM载体和表达载体pET28a（+）都用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物电泳后将目的片段胶回收。

将切胶回收纯化的目的基因和表达载体按3∶1（摩尔数）用T4连接酶进行连接，反应体积为10μl，于16℃连接过夜。

将构建的pET28a（+）cagM载体转化大肠埃希菌BL21，涂于含卡那霉素（100mg/L）的LB固体培养基的平板中，37℃生长12～16h。

挑取单个菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、250r/min摇过夜菌，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ进行酶切鉴定。

将鉴定连接成功的重组质粒pET28a（+）cagM载体送上海生工生物公司进行测序，以确定连接方向正确。

　　融合蛋白的表达纯化

　　挑阳性单克隆子接种于3ml的LB培养基中（含100mg/L卡那霉素），37℃振荡培养过夜。

取上述培养物按1∶50体积接种于新鲜LB培养基，37℃振荡培养至D为～时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养。

收集诱导4～5h的菌液，5000r/min离心液和PBS重悬菌体，100℃煮沸5～10min，离心取上清进行10%的SDSPAGE电泳分析。

蛋白Ni2+NTA柱纯化，按试剂盒的说明书操作，纯化后SDSPAGE电泳检测。

　　多克隆抗体制备

　　弗氏完全佐剂制备：

取羊毛脂3g,液体石蜡3ml,卡介苗5mg；

先研磨羊毛脂和液体石蜡至乳白色均匀糊状，逐滴加入卡介苗与目的蛋白混合物，继续研磨成油包水制剂。

　　将弗氏完全佐剂与纯化后的CagM重组蛋白按1∶1的体积比例充分研磨，制备成油包水乳化剂，吸取1ml制备好的抗原，采用每只多点免疫3次，每隔5天1次，免疫3次后用蛋白原液耳缘静脉免疫，每次约注射1ml，每隔2天1次，连续5次，末次免疫后7天心脏采血，室温放置2h后，10000×

g离心10min,吸取抗血清分装贮存于-70℃。

　　ELISA测定多克隆抗体效价

　　取适量ELISA板条，加入包被液适量稀释的CagM重组蛋白（5μg/ml）,100μl/孔，4℃冰箱过夜；

加入洗涤液，300μl/孔，静置2min,吸出洗液弃掉，反复洗3次；

加入封闭液（%牛血清白蛋白），150μl/孔，4℃冰箱过夜后，洗3次；

加入待测血清标本（倍比稀释），同时加入阴性血清及