浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆表达及抗体制备Word文档格式.docx

1、105。结论: 首次成功克隆并表达了 pNCTC 11637 cagM基因，并制备了其抗体，为以后进一步研究其生物学功能以及相关疾病的检测与治疗奠定了基础。 【关键词】 幽门螺杆菌； 型分泌系统； cagM基因； 抗体 Cloning and expression cagM gene of Helicobacter pylori type secretionsystem and antibody preparation TIAN Shu wei, SHAO Shi he, HAN Jun, HUANG He, HUANG Shi teng （Institute for Life Science

2、s; Department of Microbiology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China） Abstract Objective: To construct prokaryotic expression vector for expressing cagM（HP0537） of Helicobacter pylori（） NCTC 11637 of type secretion system, to analyze i

3、ts antigenicity and to produce antibodies. Methods： PCR technology was used to amplify cagM from thegenome. Then TA cloning was used for sequence analysis. We constructed expression vector pET 28a（+） cagM, and transformed it toBL21. IPTG was used to induce expression. After SDS PAGE for identificati

4、on of expressed protein and Ni2+ NTA column for purification, used software analysis of its antigenicity, and prepared antibody by immunization of rabbits. At last, ELISA was used to detect polyclonal antibody titers. Results: cagM gene sequencing results showed that the full length was 1 131 bp（Gen

5、Bank accession number: GU269568）, encoding 376 amino acids. Compared with strains J99, 26695 and G27, its amino acid homology was 98%99%. After the induced expression and SDS PAGE analysis, in the 43 700 position found a new band, and Ni2+ NTA column purified was a single band. The software analysis

6、 showed that the antigenicity was stronger. The prepared rabbit polyclonal antibody titer was 1 105. Conclusion: For the first time successfully cloned and expressed theNCTC 11637 cagM genes, and prepared its antibody, which provide a foundation for further study its biological function, as well as

7、the detection and treatment of Helicobacter pylori related diseases research in the future. Key words Helicobacter pylori； type secretion system； cagM gene； antibody 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, ）是一种定植于人类胃黏膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，现已证实感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因1,2，型基因组中有一个约40 kb的基因片段，即cag致病岛，其编码一些毒素蛋白和一个分泌装置，即型分泌系统，TFS

8、S形成一个跨膜通道，通过转运相关毒素如毒力蛋白CagA参与细胞信号调节，从而导致一系列病变，如胃炎、胃溃疡和胃癌等3,4。有研究发现cagM是型分泌系统的重要基因，对转运CagA和刺激上皮细胞产生炎症因子IL 8非常重要5,6。但是，关于CagM在型分泌系统中的作用及在幽门螺杆菌致病过程中的作用尚未见报道。本文针对这一现状，首次克隆表达了 NCTC 11637 cagM基因全序列，并用生物信息学方法分析了其抗原性，制备了其抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。1 材料和方法 材料 菌株及质粒 NCTC 11637由中国疾病控制中心传染病预防研究所张建中教授馈赠，大肠埃希菌 DH5，BL21和pE

9、T 28a（+） 载体为江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存，pGEM T载体购自 Promega公司。试剂和仪器 哥伦比亚培养基、厌氧袋；ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶BamH ，Xho 及T4 DNA连接酶，1 kb DNA标准，DL2000 DNA标准参照物、蛋白质分子量标准及IPTG；绵羊血；胶回收试剂盒；Ni2+ NTA；HRP 标记的羊抗鼠IgG抗体；引物；核酸紫外检测仪；PCR 仪；电泳仪；超低温冰箱ULT 790 3V；超声破碎仪XL2020；酶联检测仪；凝胶成像及分析系统Chemidoc XRS；蛋白垂直电泳仪，其他试剂均为普通分析纯试剂。方法

10、的培养与基因组提取 将 NCTC 11637 标准菌株接种于含10%羊血的哥伦比亚平板上，37，微需氧培养72 h，从培养基上刮取生长状态良好的菌落，用PBS洗涤3次收集细菌。基因组提取用酚氯仿提取法，参照分子克隆。cagM基因PCR扩增 根据基因库中已报道的的全基因组序列，用设计cagM引物，上游5 TAGGGATCCGAGCAGTTTGGTTCATTT 3；下游5 CGCCTCGAGCTATTCAAA GGGATTATTC 3，并在其5端分别加入BamH和Xho的酶切位点和保护碱基，PCR产物全长1 149 bp，PCR参数：94 5 min，94 30 s，56 45 s，72 1 mi

11、n，30个循环，7210 min。PCR产物经%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析，拍照，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。目的基因TA克隆和测序 胶回收的PCR产物与pGEM T载体连接后，转化 DH5。转化后的细菌涂布于含50 g/ml氨苄西林的LB平板筛选，挑菌于含氨苄西林的液体LB培养基中扩增，收集菌液，碱裂解法提取质粒，BamH 和Xho 双酶切鉴定，将鉴定正确的pGEM T cagM，送上海生工生物公司测序，将测序结果提交基因库，并获取登录号。生物信息学软件分析CagM化学特征及抗原性 用Antheprot 软件分析CagM蛋白的氨基酸组成、相对分子质量、

12、等电点、疏水性和抗原性等。重组表达质粒的构建和鉴定 将构建好的pGEM T cagM载体和表达载体pET 28a（+）都用BamH和Xho双酶切，酶切产物电泳后将目的片段胶回收。将切胶回收纯化的目的基因和表达载体按31（摩尔数）用T4连接酶进行连接，反应体积为10 l，于16连接过夜。将构建的pET 28a（+） cagM载体转化大肠埃希菌BL21，涂于含卡那霉素（100 mg/L）的LB固体培养基的平板中，37生长1216 h。挑取单个菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中，37、250 r /min摇过夜菌，碱裂解法提取质粒，BamH进行酶切鉴定。将鉴定连接成功的重组质粒pET 28a（+）

13、cagM载体送上海生工生物公司进行测序，以确定连接方向正确。融合蛋白的表达纯化 挑阳性单克隆子接种于3 ml的LB培养基中（含 100 mg/L卡那霉素），37振荡培养过夜。取上述培养物按150体积接种于新鲜 LB培养基，37振荡培养至D为时，加 IPTG至终浓度为 1 mmol/L，37继续培养。收集诱导45 h的菌液，5 000 r/min离心液和 PBS重悬菌体，100 煮沸510 min，离心取上清进行10%的SDS PAGE电泳分析。蛋白Ni2+ NTA 柱纯化，按试剂盒的说明书操作，纯化后SDS PAGE电泳检测。多克隆抗体制备 弗氏完全佐剂制备：取羊毛脂 3 g, 液体石蜡 3

14、ml, 卡介苗5 mg；先研磨羊毛脂和液体石蜡至乳白色均匀糊状，逐滴加入卡介苗与目的蛋白混合物，继续研磨成油包水制剂。将弗氏完全佐剂与纯化后的CagM重组蛋白按11的体积比例充分研磨，制备成油包水乳化剂，吸取1 ml制备好的抗原，采用每只多点免疫3次，每隔5天1次，免疫3次后用蛋白原液耳缘静脉免疫，每次约注射1 ml，每隔2天1次，连续5次，末次免疫后7天心脏采血，室温放置2 h后，10 000g离心10 min, 吸取抗血清分装贮存于-70。ELISA测定多克隆抗体效价 取适量ELISA板条，加入包被液适量稀释的CagM重组蛋白（5 g/ml）, 100 l/孔，4冰箱过夜；加入洗涤液，300 l/孔，静置2 min, 吸出洗液弃掉，反复洗3次；加入封闭液（%牛血清白蛋白），150 l/孔，4冰箱过夜后，洗3次；加入待测血清标本（倍比稀释），同时加入阴性血清及