植物合成生物学的现在与未来Word文档格式.docx

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随着世界人口快速增长与资源日益减少，人类必须开发新型高效生物系统，以满足对食品、药品、能源不断增长的需求。

合成生物学作为一门新兴的交叉学科，在工程学思想的指导下，结合不同生物学领域的知识技术，能以各种理想的方式设计改造生物系统。

该领域过去十多年的发展，从设计生物装置、建立代谢通路到合成基因组，大多是在微生物底盘中进行的，但随着研究的深入，简单的单细胞体系已无法满足发展需求，需要向多细胞的复杂体系过渡，因此植物合成生物学日益兴起。

由于调控网络的集成性、信号组分的冗余性，植物的基因型和表型之间的联系并不明显，复杂的相互作用影响了研究人员在系统水平上对植物基因功能与作用机制的研究，进而阻碍育种策略的改善。

植物合成生物学以一种自下而上的方法将生命系统细分为不同的功能模块，例如代谢途径模块、调控通路模块等，随后将其组合成新型系统，有助于更好地理解复杂的生物学过程。

本文作者将回顾植物合成生物学近年来在基础研究方面的重要进展（图1），阐述其在农业生产、生物医药、能源资源可持续发展方面发挥的作用，展望该领域未来发展方向。

图1 

植物合成生物学近年的发展

1 

植物元件与装置开发设计

元件作为植物合成生物学基本要素，深入挖掘和功能鉴定是该领域内的重要工作。

英国约翰英纳斯中心（JohnInnesCentre）为首的研究团队近期系统评估了大量调控元件对基因表达的影响，发现pBdEF1α、p35S、pAtUBI10、pOsUBI3、pZmUBI、pBdUBI10和pOsPGD17个启动子和t35S、tNOS、tH4、tAdh和tOCS5个终止子在单、双子叶植物的叶片和根中都有较高的强度，可用来驱动目的基因表达或用于构建多基因复合性状载体。

绝缘子位于启动子与调控元件之间，具有隔绝其他元件对基因进行调控的功能，因此这一类顺式作用元件可在植物合成生物学中起到稳定外源基因表达、降低位置效应作用。

为了挖掘有价值的绝缘子序列，Perez-Gonzalez等对来自烟草、鸡溶菌酶、拟南芥的基质结合区（matrixattachmentregions,MAR）和矮牵牛的转化促进序列（transformationboostsequence,TBS）进行测试，发现上述4种绝缘子序列均能够增强外源基因表达，并且拟南芥MAR序列还能够减小基因表达的变动幅度。

尽管越来越多生物元件被鉴定测试，但自然界固有的元件有时无法满足植物合成生物学的需求。

例如进行植物基因编辑时使用的野生型水稻U3/U6启动子长度较大，不仅构建sgRNA表达盒时连接效率低，而且串联连接sgRNA-linker重复单元时转录能力有限。

为解决这一问题，Hao等对该类启动子进行保守元件保留、5′端上游序列（upstreamsequenceelement,USE）去除、创建单子叶植物特异启动子（monocot-specificpromoterelement,MSP）等改造，获得了转录活性更高的精短型的小核RNA启动子，为植物多基因编辑提供了强有力的工具。

细胞色素P-450氧化酶作为广泛存在于生物体内的催化元件，在天然产物合成和外源物质代谢中具有关键作用，但这类催化元件参与的生化反应存在催化效率低、底物专一性差等特点，限制了其应用。

近年来，Arnold教授课题组以P-450氧化酶为研究对象，利用定向进化先后实现了其高效催化烯烃的反马氏氧化、双环丁烷的构建及卡宾的碳氢插入反应，展示了催化元件可以通过改造打破自然进化的限制。

植物合成生物学的核心思想是基于标准化的生物元件进行工程化改造以获得新型生物功能，因此对于元件的定量和标准化是现阶段亟需解决的问题。

Schaumberg等已开发出一种利用原生质体瞬时转化和双重荧光素酶输出强度对遗传元件进行快速定量表征的方法，通过观察瞬时表达测定法中的实验变异性，开发对应的数学模型以及统计归一化方法，从而提取定量参数。

尽管国际基因工程机器大赛自2010年开始收录植物来源标准生物元件，但是由于这些元件由不同参赛者提供，未经系统校准，在后期组装时可能存在兼容性问题，无法高效地完成新系统的构建。

因此，2015年英国生物技术和生物科学研究理事会（TheBiotechnologyandBiologicalSciencesResearchCouncil,BBSRC）和工程与自然科学研究理事会（TheEngineeringandPhysicalSciencesResearchCouncil,EPSRC）等机构对植物标准元件做出如下规定：

①元件内部应无BsaI识别序列，同时为了与GoldenGate模块化克隆（modularcloning,MoClo）和GoldenBraid2.0（GB2.0）兼容，应避免BpiI、BsmBI识别位点；

②不同类型元件须对应不同融合位点；

③标准元件两侧应引入BsaI识别序列和定义的融合位点。

利用不同元件合理规划可以设计遗传装置，植物合成生物学现阶段最具有代表性的遗传装置为各类传感器和遗传开关。

植物传感器主要组成部分通常包括输入元件和输出元件，前者可识别如Ca2+、pH、激素、初级代谢物、活性氧、营养元素等反映植物生理状态的内源信号，后者能将其转化为不同的信号，如荧光、代谢通路的关闭等信号。

2011年Fernandez-Fuentes等建立了第一个可以监测环境中TNT小分子的植物传感器。

接着Luo等利用pH传感器pHusion与高尔基体/初级内体（trans-Golginetwork/earlyendosome,TGN/EE）标签SYP61融合，通过检测TGN/EE膜内外酸碱变化揭示了酸化对于植物系统分泌和循环的重要性。

植物遗传开关装置可根据特定化合物、光等外源信号，对基因表达进行转录和翻译水平上的调控。

常见的化学诱导开关有受IPTG诱导的乳糖操纵子系统、四环素诱导的TetR/tetO系统、乙醇诱导的AlcR/AlcA系统、地塞米松诱导的pOP/LhGR系统、β-雌二醇诱导的XVE/OlexA系统等。

由于化学诱导物的丰度、扩散速度和细胞毒性在植物体内的限制，这类开关只能在有限的时空发挥作用。

近年来，光遗传学技术因其无损、可逆、非入侵等特点，正成为一种动态调控基因表达新策略。

目前光控开关主要来源于细菌和植物的光受体，如UV-BRESISTANCE8、phototropin1/EL222/CRYP-TOCHROME2、CarH、PHYTOCHROMEB/A。

其中基于PHYTOCHROME和CarH的光控开关在植物体内率先试验成功。

最近，Bernabe-Orts等利用噬菌体ΦC31位点特异性整合酶设计出针对植物的记忆开关，通外部操控ΦC31整合酶及其重组方向因子（recombinationdirectionalityfactor，RDF）来控制目标基因的转录状态。

由于植物合成生物学设计该过程中涉及大量元件选择、参数改进、网络层系结构优化，因此需要强大的计算机辅助设计（computeraideddesign,CAD），目前已有用于设计和优化植物元件的GeneDesigner、GenoCAD，可改进用于设计植物拓扑结构和网络的OptCircuit、SynBioSS、e-Cell及模拟分析植物形态发生过程中细胞间相互作用的CellModeller，但考虑到植物系统输出的多样性和目前可用资源的有限性，未来这些工具的开发应跟上发展的需求。

2 

应用于植物合成生物学的使能技术

植物合成生物学的迅速发展离不开各类使能技术的开发，从多片段大尺度的DNA组装，到精确便捷的基因编辑工具，再到高效稳定的转化方法，逐步实现了对植物整体的设计重构。

2.1 

DNA组装

目前植物合成生物学常用的体外组装技术主要依赖于重叠序列或IIS型限制性内切酶，前者典型代表为Gibson等温一步法，后者常见为GoldenGate，并衍生出GoldenBraid、GreenGate和MoClo等方法。

由于GoldenGate构建的片段符合合成生物学的标准化与模块化思想，Pollak等在此基础上开发出基于递归的Loopassembly，通过在两个载体间循环，可以将标准的0级元件组装成包含1个、4个、16个或更多基因的转录单元，组装尺度达38kb，效率大于80%。

尽管目前可用的高效率组装方法不少，但无痕拼接和模块化组装似乎总是矛盾的。

为了解决这个问题，Hochrein等引入了AssemblX的组装流程：

允许从单基因水平进行多个元件无痕、不依赖序列的标准化、模块化从头组装，实现多达25个功能单元的构建。

除上述这些胞外组装方法，Shih等利用酵母体内同源重组开发了jStack技术，不仅能组装紫色杆菌素的整个合成途径，还可实现20.50kb大小的基因簇构建。

近年来，高通量的自动液体处理机器人（automatedliquid-handlingrobots）技术的应用也推动了DNA自动化组装的发展，Storch等对开发的DNA-BOT平台进行测试，同时进行含10种遗传元件的88种类型组装和转化，实验证明整个构建测试仅需1.5h，高效高精度构建平均成本可控制在1.50～5.50美元。

2.2 

基因组编辑

基因组编辑技术能够精准靶向及特异性修饰植物基因组，进行基因功能研究，为物种定向改造奠定基础。

目前研究人员使用最多的植物编辑技术为CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统，能够实现基因敲除、插入（替换）和单碱基编辑。

刘耀光团队利用植物密码子优化的Cas9基因，将靶向不同基因的多个sgRNA表达盒组装转化后可同时敲除水稻中7个基因，效率达85.40%。

2019年Decaestecker等引入细胞特异性的启动子，开发出的CRISPR-TSKO（CRISPR-basedtissue-specificknockoutsystem）技术能够针对特定的细胞类型、组织、器官进行高效敲除。

自Komor等开发单碱基编辑技术以来，基因编辑领域进入一个更为精准的时代。

目前常见的胞嘧啶碱基编辑器（cytidinebaseeditors,CBE）、腺嘌呤碱基编辑器（adeninebaseeditors,ABE）已在水稻、小麦、番茄、玉米、拟南芥等多个物种中实现了应用。

由于单碱基编辑器的编辑能力有限，且可能存在严重的脱靶效应，因此Lin等建立起适用于植物任意碱基编辑的技术——植物引导编辑技术（plantprimeediting,PPE），在水稻和小麦的原生质体中实现12种类型、16个位点的精确编辑。

2020年初，新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器（saturatedtargetedendogenousmutagenesiseditors,STEME）构建成功，实现了水稻乙酰辅酶A羧化酶基因（acetyl-coenzymeAcarboxylase,ACC）定向进化，获得除草剂抗性突变，为快速获得有益农艺性状提供了可能。

除上述RNA介导的基因编辑，为了避免外源片段整合到基因组中的潜在风险，研究人员尝试将