密度梯度离心基础Word下载.docx

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对于速率—区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉淀后来分离样品；

而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。

密度梯度离心法的理论基础是（参考文献1）

每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：

式中：

v是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）

d：

样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假设样品颗粒为球体。

非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。

σ：

样品颗粒的密度（克/厘米3）

ρ：

密度梯度液的密度（克/厘米3）

η：

密度梯度液的粘性系数（克/厘米•秒）

ω：

离心机主轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷

60，N：

转/分

r：

颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）

当：

σ>

ρ时，v>

0即样品顺离心力方向沉降

σ<

ρ时，v<

0即样品逆离心力方向上浮

σ=ρ时，v=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置

用这个公式可以很好地解释在速率—区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。

二、转头的选择：

1、离心转头分类：

转头类别

使用的离心机

发明时间、发明者或推广商

固定角式转头

低、高、超速

1943年，（英）Pickels

甩平转头

1951年，（德）Kahler

垂直管转头

高、超速

1974~1975年，（美）Dupont公司

区带转头

1964~1965年（英）Anderson

近垂直管转头

超速

1989年，（日）HitachiKoki（美）Beckman公司

连续离心转头

1965年，（英）MSE公司

其他特种转头：

分析转头、土壤脱水转头、细胞浮选转头、管式转头、血球比测定转头、细胞淘洗转头等等。

2、各种转头用于密度梯度离心的比较：

（1）各种转头用于速率—区带（R-Z）离心的优缺点分析：

A、固定角式转头：

壁部效应影响很大，用于R-Z离心回收率低，纯度也受影响一般只用于差分离心和等密度离心，离心时间较短。

是各类离心机的最高速转头。

B、甩平转头：

细长离心管用于R-Z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部效应很小。

25,000rpm~30,000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40,000~42,000rpm的甩平转头适用于核酸、蛋白、病毒等类物质的分离。

离心时间较长。

C、垂直管转头：

沉降距离最短，因而离心分离时间也最短。

最大半径前几乎没有壁部放位，最大半径后有一定壁部效位，垂直剖面积较大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。

但在有沉淀的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。

大部分R-Z离心没有沉淀，垂直管转头很适合做R-Z离心。

D、近垂直转头：

管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式、甩平转头都要短。

由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑向底部，因此基本上消除了沉淀与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-Z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。

E、区带转头：

没有壁部效应特别适合做大容量的病毒、亚细胞器、生物大分子的R-Z离心，可用于研究、中试和小批量生产。

分离纯度高，量大，但操作要求高，转头及附件价格昂贵。

F、连续流离心转头：

工作原理与区带转头相似，可连续工作，分离量大，分离纯度高，可用于各种生物体的差分、R-Z及等密度离心。

近年来高速连续流转头常用于大量发酵液（大肠杆菌、细胞）菌体的沉淀。

（2）各种转头用于等密度离心的优缺点分析：

主要用于差分离心的角式转头，在超速离心机上可以很好地用于等密度离心，尤其是DNA平衡等密度离心，自形成梯度，用快速密封管或厚壁管，常用的单管的容量为10~40ml。

常用转速40,000~80,000rpm，离心时间较短，分离纯度也较高。

用作等密度离心时，壁部效应对分离效果影响较小，梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验，优点是回收率高，分辨能力强。

缺点是沉降距离长，最高转速较低（由于结构原因此类转头最高转速一般在60,000rpm以上）因而，离心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量的转头最高速在40,000~41,000rpm，用作自行成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要50~70小时。

适合作等密度离心，沉降距离最短，在没有沉淀或沉淀非常坚实的情况下，对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机，梯度转换得很好。

这类转头转速很高（目前最高转速可达

100,000rpm，700,000×

g）离心时间最短，分离纯度高，样品容量较大（垂直剖面积最大）。

九十年代开始使用的新型转头，用作生物大分子（DNA，RNA，蛋白质等）的平衡等密度离心最佳，目前这类转头的最高转速已达100,000rpm近750,000×

g），离心时间比垂直转头稍长。

非常适合做大容量样品的等密度离心。

高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心，超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。

三、密度梯度——材料和梯度型式的选用

1、对于速率-区带密度梯度离心，梯度选择要点

（1）概述：

用速率-区带法（Rate-Zonal，简称R-Z法）进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离纯化样品，因此希望样品沉降能通过整个离心管长度来提高分辨率。

作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须小于样品颗粒的密度。

用有密度梯度的支持液作R-Z离心有以下优点：

●当样品中不同组份分层进入梯度液时，梯度的较高密度支持着样品，这样就使混合样品中各个不同密度的层次以较窄（或较薄）的区带沉降从而得到较高的分辨率（或较高的纯度）。

●梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加，这样就可以稳定液柱，提高抗对流和抗机械扰动的能力（接近离心过程结束时，纯样品区带和它的支持液的密度差较小）。

●梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率。

而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠拢，提高了分离纯度。

（2）梯度材料的选用

一个理想的梯度液应具备：

化学稳定性好；

高溶解度；

低渗透性；

在溶剂中的稳定性；

较低的光吸收特性；

低廉等。

遗憾的是很难找到一种适合于各种R-Z离心的完美无缺的梯度液。

对于大多数R-Z离心，蔗糖是比较合适的梯度材料。

尽管它在高密度（40~60%W/W）时粘性系数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。

但由于蔗糖在各种密度时（即使是低密度时也如此）有较高的渗透性，分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料，如由Pharmacia公司开发的Ficoll等等。

在大多数情况下，梯度液的PH值应与被分离时生物制品的生理PH值一致。

对密度梯度材料的基本要求：

（a）能够配制所需要的密度范围

（b）粘性系数较低

（c）溶解度高

（d）有密度与光折射率的对照资料

（e）对被分离样品无损害

（f）对被分离样品渗透很少

（g）在离心分离完成后很容易与生物样品分离

（h）化学性能稳定

（i）对离心过程中所接触的转头材料，离心管，管盖及密封件，连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用。

（j）纯度高

（k）毒性少

（l）价格较低

（m）已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。

常用的梯度材料有：

蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钾、碘化钾、氯化铯、氯化铷、三氯醋铯、三氟醋酸铯、右旋糖苷、白蛋白、Ficoll、Percoll、Metrizamide、Nycodenz、Ludox、Dextran等等。

（3）梯度形状的选择

所谓梯度形状是指梯度介质沿着离心管长度方向的密度变化特征。

用于R-Z离心密度梯度常用连续梯度也就是密度随着离心半径的增加而光滑地（不是突变地）增大，直线型的，光滑曲线型的（一般用凸指数或凹指数曲线，或凸凹指数曲线联用的）都属于连续梯度。

不连续（阶梯型）梯度多用于等密度离心。

●线性梯度：

在甩平转头中做R-Z离心最常用线性梯度。

制备线性梯度时要注意：

在甩平或垂直转头中制备线性梯度时，梯度液面的密度必须足以支持样品，而底部密度必须小于被分离样品各个组份的密度。

一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率。

蔗糖的常用线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V。

可以用梯度仪制备线性梯度，也可以人工铺设数个阶梯型梯度，离心管静置一段时间后也可以形成近线性梯度。

●等运动梯度（等速梯度）（Isokinetic）

等运动梯度是指在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。

要做到等速沉降，必须使梯度液密度和粘性力的增加与沿着离心半径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离心力，以及颗粒本身的沉降系数成正比。

因此如果已知某单一组份样品的沉降系数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。

在甩平转头中用等速沉降梯度时，从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。

为了构造等速沉降梯度我们必须注意到转头、离心管，梯度介质的密度、浓度和粘性系数在同一温度。

在甩平转头中作蛋白质分离常用5~20%（W/V）蔗糖梯度在5℃离心可以达到近似的等速沉降的效果，而10~30%（W/V）的甘油梯度在5℃时DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的，其他大多数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。

●凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度：

为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常希望梯度曲线在近液面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。

这就是凸指数曲线梯度，与此相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故考虑到某些样品在离心