流式细胞仪操作规程sopWord下载.docx
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白血病免疫分型测定
8:
淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
9:
XL操作步骤
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200年月日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期:
年月日
复审人:
规程编写者:
审批者:
批准日期:
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科主任:
检验科实验室:
(CD系列)
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群的百分数。
淋巴细胞表面抗原分布如下:
T淋巴细胞:
CD3+;
B淋巴细胞:
CD5+,CDl9+;
辅助性T淋巴细胞:
CD3+CD4+;
抑制性T淋巴细胞:
CD3+CD8+;
NK细胞:
CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同,流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群,利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态,空腹采血。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×
109/L之间。
若>
10.0×
109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;
若<
4.0×
109/L,应分离单个核细胞。
4.溶血样本不能用。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体1ML2—8℃
2:
全血溶血试剂液体
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
3:
鞘液液体20L室温
4:
清洗液液体5L室温
5:
荧光微球液体10ML2-8℃
质控品BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;
每天校准一次:
遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样)
报告结果
报告百分数(和绝对值)
操作性能
精密度批内五次重复CV<
2%
灵敏度500—1000个荧光素分子
参考值(百分数(绝对值))
CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)
CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)
Th/Ts1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标,在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th/Ts比值升高:
表示免疫功能亢进:
见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th/Ts比值减低:
表示免疫功能下降:
艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞,所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。
NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退。
NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应,白介素-2治疗后;
外周血NK细胞增加。
方案(Protocol)
方法
双色直接免疫荧光法。
将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗体结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)
5)洗、离心、上机测样(备注:
测B27一定要至少洗一遍方可上机检测)
报告阴阳性
参考值
阳性:
HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上,该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因,与多种疾病具有相关性,尤其是强直性脊柱炎。
CD55/CD59测定
近年的研究表明,红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。
血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。
用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
3.溶血样本不能用。
样本制备:
(一)白细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记。
分别向二管中加入样品100ul。
2.溶血:
3.离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
避光20-30分钟。
4.洗涤离心
5.上机测样
(二)红细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记
2.分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
3.向二管中加入1:
200稀释的样品100ul(可根据红细胞的数量调整),避光20-30分钟。
4.洗涤离心。
5.混匀、上机测样。
报告百分数
CD55>
97%CD59