流式细胞仪操作规程sopWord下载.docx

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白血病免疫分型测定

8：

淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定

9：

XL操作步骤

（流式细胞仪）

医院检验科

操作规程文件号：

200年月日起实施

第1版

（共3页）

本规程每2年复审一次

复审日期：

年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

（CD系列）

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：

T淋巴细胞：

CD3+；

B淋巴细胞：

CD5+，CDl9+；

辅助性T淋巴细胞：

CD3+CD4+；

抑制性T淋巴细胞：

CD3+CD8+；

NK细胞：

CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×

109/L之间。

若>

10.0×

109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；

若<

4.0×

109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体1ML2—8℃

2：

全血溶血试剂液体

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

3：

鞘液液体20L室温

4：

清洗液液体5L室温

5：

荧光微球液体10ML2-8℃

质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；

每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度批内五次重复CV<

2％

灵敏度500—1000个荧光素分子

参考值（百分数（绝对值））

CD3+60.8-75.4%（1141-1880）CD4+29.4-45.8%（478-1072）

CD8+18.2-32.8%（393-742）NK9.5-23.5%（175-567）

Th/Ts1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：

表示免疫功能亢进：

见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：

表示免疫功能下降：

艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。

NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。

NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；

外周血NK细胞增加。

方案（Protocol）

方法

双色直接免疫荧光法。

将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照（IgG2a-FITC／IgG1-PE）

5）洗、离心、上机测样（备注：

测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）

报告阴阳性

参考值

阳性：

HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。

HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。

CD55/CD59测定

近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。

血细胞（红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。

用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

3．溶血样本不能用。

样本制备:

（一）白细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。

分别向二管中加入样品100ul。

2．溶血：

3．离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。

避光20-30分钟。

4．洗涤离心

5．上机测样

（二）红细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记

2．分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。

3．向二管中加入1：

200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。

4．洗涤离心。

5．混匀、上机测样。

报告百分数

CD55>

97%CD59