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如果检测性能或者是产品发生变化，则必须对方法的适用性进行确认，因为这可能会对检测结果产生影响。
3-1.试验用菌株的制备
使用符合标准要求的稳定的试验菌种菌悬液或按照以下方法制备菌悬液。
采用种子批培养维护技术（种子批系统），从原始主种子批计，种子批传代次数不得超过5代。
3-1-1.需氧菌将各个试验用菌株分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，于30-35℃培养18-24小时。
将白色念珠菌试验菌株接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，于20-25℃培养2-3天。
-金黄色葡萄球菌，例如ATCC6538,NCIMB9518,CIP4.83或NBRC13276;
-铜绿假单胞，例如ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118或NBRC13275;
-大肠埃希菌，例如ATCC8739,NCIMB8545,CIP53.126或NBRC3972;
-肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型，例如ATCC14028或以肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型，例如NCTC6017或CIP80.39作为替代菌种;
-白色念珠菌，例如ATCC10231,NCPF3179,IP48.72或NBRC1594.
使用pH为7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH为7.2的磷酸盐缓冲液制备试验用菌悬液。
菌悬液应在2小时内使用，如果菌悬液在2-8
℃条件下保存，则应在24小时内使用。
3-1-2.梭状芽孢杆菌.使用生孢梭菌，例如ATCC11437（NBRC14293,NCIMB12343,CIP100651）或ATCC19404（NCTC532或CIP79.03）或NBRC14293。
在厌氧条件下将生孢梭菌试验菌株接种在梭菌增菌培养基中，于30-35℃条件下培养24-48小时。
或者是制备新鲜的有活性的生孢梭菌菌孢子悬液，然后进行稀释，获得稳定的孢子混悬液用于接种。
该稳定的孢子悬液可在2-8
℃条件下保存，并在经过验证的贮存期内使用。
3-2.阴性对照试验
为了确认试验条件是否符合要求，应该用所选用的稀释剂代替供试品进行阴性对照试验。
阴性对照试验应无菌生长。
按照第四部分对供试品进行检测时，也需要做阴性对照试验。
如果阴性对照试验结果不符合要求，应进行偏差调查。
3-3.培养基的生长促进作用和生长抑制作用
每一批成品培养基，以及每一批由脱水培养基或按规定处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。
按照表2.6.13.-1的要求，对相关培养基的适用性进行确认。
液体培养基的促生长能力检查：
分别将少量的（不超过100CFU）的相应试验菌种接种在适当的培养基中。
然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。
与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检查的培养基试验管有清晰可见的微生物生长。
固体培养基的促生长能力检查：
用涂布法分别接种，每个培养基平皿分别接种少量的（不大于100CFU）相应试验菌种。
然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不超过试验规定的最短培养时间。
与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小和形态特征应一致。
固体或液体培养基的抑制能力检查:
在相应的培养基中接种不少于100CFU的相应试验菌。
然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养不小于试验规定的最长培养时间。
试验菌应不得生长。
培养基的指示特性检查：
用涂布法分别在每个相应的培养基平皿中接种少量的（不大于100CFU）相应试验菌种。
然后在相应的控制菌规定的培养温度下培养一定的时间。
与以前检测得到的试验管或者已经批准的培养基批次进行比较，菌落大小形态UI集指示剂反应情况应与对照培养基一致。
3-4.控制菌检查方法的适用性试验按照第四部分中相关段落的规定制备供试品溶液。
混合的时候，分别将各个试验用菌株加入到指定的培养基中。
每个试验用菌株分别接种。
供试品溶液中微生物的接种量应小于100
CFU。
按照第四部分中相关段落的方法进行试验，培养时间应为微生物试验时规定的最短时间。
必须按照第四部分的要求对控制菌进行指示特性反应检查。
如果供试品对试验菌有抗菌活性，则必须检查过程进行修正（参见
2.6.12章节中的4-5-3）。
如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌活性无法消除，那么可以认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中。
表2.6.13.-1–控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性
培养基
特性
试验菌株
耐胆盐革兰氏阴性菌的检查
肠道菌增菌液体培养基-肠内杆菌培养基
促生长能力
大肠埃希菌
铜绿假单胞菌
抑制能力
金黄色葡萄球菌
紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
促生长能力+指示特性
大肠埃希菌的检查
麦康凯液体培养基
麦康凯琼脂培养基
沙门氏菌的检查
RV沙门菌液体增菌培养基
肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型或肠道沙门氏菌肠道亚种阿邦尼血清型
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
铜绿假单胞菌的检查
溴棕三甲铵琼脂培养基
金黄色葡萄球菌的检查
甘露醇氯化钠琼脂培养基
梭菌的检查
梭菌增菌培养基
生孢梭菌
哥伦比亚琼脂培养基
白色念珠菌的检查
沙氏葡萄糖液体培养基
白色念珠菌
沙氏葡萄糖琼脂培养基
4.供试品检查
4-1.耐胆盐革兰氏阴性菌
4-1-1.供试品溶液制备和预培养按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂制成1:
10的供试品溶液，
混匀，于20-25℃条件下培养，培养时间应使供试品中的细菌充分恢复但是又不会使其增殖（通常在2-5小时范围内）。
4-1-2.定性试验除另有规定外，取4-1-1中制备的相当于1g供试品的预培养物溶液接种至肠道菌增菌液体培养基中，于30-35
℃条件下培养24-48
小时，然后将培养物转种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，于30-35
℃条件下培养18-24小时。
如果平板上无菌落生长，说明供试品中未检出耐胆盐革兰氏阴性菌。
4-1-3.定量试验
4-1-3-1.选择和分离培养.取4-1-1制备的分别含有0.1g,
0.01g和0.001
g
（或
0.1
ml,
0.01
ml
和
0.001
ml）供试品的预培养物或其稀释液接种至适量体积的肠道菌增菌液体培养基中，于30-35
小时，然后分别将各个培养物接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上，于30-35
4-1-3-2.结果判断
如果培养基上有菌落生长说明试验结果为阳性，记录产生阳性试验结果所使用的供试品的最小量和产生阴性结果所使用的供试品的最大量。
根据表2.6.13.-2确定出供试品中含有耐胆盐革兰氏阴性菌的可能菌数。
表2.6.13.-2-结果判断
各供试品量的检查结果
每1g（或1ml）供试品中可能的菌数
0.1g或0.1mL
0.01g或0.01mL
0.001g或0.001mL
+
>
103
-
<
103和>
102
102和>
10
10
4-2.大肠埃希菌
4-2-1.供试品溶液制备和预培养.按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂，制成1:
10的供试液，
取供试液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中（按照3-4的要求），混匀，于30-35℃条件下培养18-24
小时。
4-2-2.选择和分离培养.振动容器，将1ml胰酪大豆胨液体培养物转移到100ml的麦康凯液体培养基中，于42-44℃条件下培养24-48
然后将培养物接种于装有麦康凯琼脂培养基的平板上，于30-35
℃条件下培养18-72小时。
4-2-3.结果判断.如果麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应对其进行鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌。
如果麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或者是虽然有菌落生长，但是鉴定结果为阴性，则判断为供试品中未检出大肠埃希菌。
4-3.沙门菌
4-3-1.供试品溶液制备和预培养.按照通论2.6.12中的方法，取不少于10g或10ml的供试品，制成供试液（按照3-4的要求），
接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，于30-35℃条件下培养18-24
4-3-2.选择和分离培养.取上述胰酪大豆胨肉汤培养物0.1ml,接种到10ml的RV沙门菌增菌液体培养基中，于30-35℃条件下培养18-24小时。
然后取少量RV沙门菌增菌液体培养物，接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30-35℃条件下培养18-48
4-3-3.结果判断.如果木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有红色菌落生长，菌落中心有或无黑色，则说明供试品中可能含有沙门氏菌。
应进一步对其进行鉴定试验，确证是否为沙门氏菌。
如果平板上没有菌落生长，或者虽然有菌落生长，但不是这种菌落特征或鉴定试验结果为阴性，则判断为供试品中未检出沙门氏菌。
4-4.铜绿假单胞菌
4-4-1.供试品溶液制备和预培养.按照通论2.6.12中的方法，取不少于1g的供试品，制成1:
取供试品溶液10ml，或相当于含供试品1g或1ml的供试液，接种于适量的胰酪大豆胨液体培养基中（按照3-4的要求），混合均匀。
如果是检测透皮贴剂，取一剂量的供试品，按照通论2.6.12
中
4-5-1中的方法制备供试品溶液，然后用无菌滤膜对供试品溶液进行过滤，再接种于100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
于30-35℃条件下培养18-24
4-4-2.选择和分离培养.将上述培养物接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，于30-35℃条件下培养18-72小时。
4-4-3.结果判断.如果溴化十六烷基三甲铵琼
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