蛋白质等电点测定Word文档格式.docx
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由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：
溶液中反离子与溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：
指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小与测量方式？
ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：
蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；
又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。
而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。
如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。
在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。
如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。
蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电：
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。
其定义为：
在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。
等电点的应用：
主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。
蛋白质等电点的测量方式：
溶解度最低时的溶液pH。
在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。
蛋白质在等电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。
蛋白质等电点的测定
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH12.0~12.4。
本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。
蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。
等电聚焦电泳（IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis）
利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。
IEF的基本原理
在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离与等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
沉淀反应：
蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。
主要的沉淀现象有
（1）盐析：
在蛋白质水溶液中加入足量的盐类（如硫酸铵），可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。
这是一个可逆的过程，可用于蛋白质的分离与初级提纯。
（2）变性：
在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下，引起蛋白质某些理性质改变和生物学功能丧失。
这是一个不可逆过程。
（3）加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时间内是可逆反应；
（4）加入生物碱试剂（含氮的碱性物质）：
能使生物碱沉淀或作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。
当溶液的pH小于PI时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合而生成沉淀。
酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分，常温下在水中可溶解0.8~1.2%，微溶于25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分。
当浸入水中则迅速膨胀。
在牛奶中以磷酸二钙、三钙或两者的复合物形式存在。
构造极为复杂，没有确定的分子式。
分子量约为57000~375000，在牛奶中约含3%，占牛奶蛋白质的80%。
三、器材与试剂：
1．器材：
①试管1.5×
厘米（×
9）。
②吸管1毫升（×
2），2毫升（×
2），10毫升（×
2）。
③容量瓶50毫升（×
2），500毫升（×
1）。
④试管架。
2．试剂：
①0.01mol·
L-1醋酸溶液。
②0.1mol·
③1mol·
④1mol·
L-1氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。
⑤酪蛋白。
四、操作步骤：
1．制备蛋白质胶液
（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。
（2）加入50毫升1mol·
L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。
将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1mol·
L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。
（4）加入蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1mol·
L-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。
2．等电点测定
按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。
管号
蛋白质
胶液
（毫升）
H2O
0.01mol·
L-1
HAC
0.1mol·
1mol·
pH
观察
分钟
10分钟
20分钟
1
2
3
4
5
6
7
8
9
8.38
7.75
8.75
8.50
8.00
7.00
5.00
1.00
7.40
0.62
1.25
—
0.25
0.50
2.00
4.00
1.60
5.9
5.6
5.3
5.0
4.7
4.4
4.1
3.8
3.5
观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。
观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。
3.蛋白质性质实验
（1）蛋白质的盐析
在试管里加入1~2毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸铵饱和溶液，观察现象，有无白色浑浊产生。
滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。
（2）蛋白质的变性
在试管里加入2毫升蛋白质的水溶液，沸水浴加热5分钟，观察现象。
把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。
在试管里加入3毫升蛋白质的水溶液，加入1毫升硫酸铜溶液，观察现象。
（有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生）。
把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。
五、思考题
1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？
请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。
在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
2、本实验中，酪蛋白质在等电点时从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白质在等电点时必然沉淀出来。
这种结论对吗？
为什么？
不一定会沉淀，因为蛋白质表面有亲水基团，只是在等电点的时候颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒，因而最不稳定，溶解度最小，易沉淀析出。
3、在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？
不同的蛋白质有不同的等电点，在分离蛋白质的时候只要调节混合蛋白质溶液的pH值，就可以在不同的pH下得到不同的蛋白质。
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