小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定Word文件下载.docx
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具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定等优点。
为满足各项技术的研究要求，需要通过控制合适的培养条件，使大肠杆菌迅速持续地生长，获得高产培养物。
本实验使用小型发酵罐对大肠杆菌进行分批培养。
发酵罐配备控制系统，能对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。
所测定的大肠杆菌在发酵过程中的各项生化指标，可提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息，作为研究和控制发酵过程的基础。
一、材料与方法
（一）实验材料
1．菌种
大肠杆菌（E.coli）
2．培养基
种子培养基：
葡萄糖1.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，牛肉膏1.0g，氯化钠0.5g，水100mL，pH7.0。
发酵培养基：
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000mL，pH7.0。
3．仪器设备
BIOTECH-7BGZ发酵罐1套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧（DO）电极、空压机及所有连接管）、分光光度计、旋转式摇床、离心机、烘箱等。
4．试剂
泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。
（二）实验方法
实验流程：
培养24h培养12h培养10h
菌种→斜面——→一级种子——→二级种子—————
37℃（250mL摇瓶）37℃（500mL摇瓶）37℃
培养基
↓8～10h
发酵罐——→管路准备→实罐灭菌→发酵——→放罐
37℃
↓
取样→分析测定
1.菌种准备
（1）配制种子培养基
配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa（121℃）灭菌20min，然后摆成斜面。
配制种子培养液500mL，各分装50mL于两个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下的培养液装进三个500mL的三角瓶中（作二级种子瓶），0.1MPa（121℃）灭菌20min。
（2）接种与培养
上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h。
上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37℃振荡（125r/min）培养12h，然后转接二级种子瓶，37℃振荡（125r/min）培养10h。
2．上罐前的准备及实罐灭菌
（1）洗净发酵罐及各联接胶管。
（2）配制发酵培养基4000ml，置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。
（3）安装好发酵罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套溢流口V2、进水阀W1，使夹套充满水。
（4）用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开进水阀门S1，进行在位灭菌。
（5）将灭菌温度设为115℃，保温时间0.33h，设为自动。
当达到795s时，灭菌温度达到121℃。
（6）灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。
（7）用75%酒精消毒pH电极和DO电极，接入发酵罐，连接各电极导线。
（8）流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设为15%，下限设为0，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。
（9）设定搅拌转速为300r/min，空气流量2~3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。
3.发酵操作
（1）当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样（用于接种前培养基成分分析）：
松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3。
（2）接种：
将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移取火焰圈。
接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
4.发酵管理
（1）控制发酵过程的各项参数（温度、PH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等），如参数出现异常现象，则应及时排除。
（2）每小时取一次样，每次取样50ml。
取样时先将空气流量计旋钮调至0~1L/min，松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入量筒，当达到40mL，开J2排出取样管内残料，夹紧J3、J2。
将样液入标记有取样时间的三角瓶，用保鲜膜封口，立即入冰箱冷藏，取完样要及时清洗量筒。
（3）每次取样前（每隔1小时）记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。
5.发酵过程中各生化指标的测定
（1）测定OD值
大肠杆菌标准曲线的绘制：
取10mL离心管，与105℃烘2h至恒重，用镊子夹取入干燥器，待冷却后于分析天平上称重（W0），精确到小数后4位，然后准确取10mL发酵液，于3000rpm离心10min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀，同上离心，弃上清液，与100℃烘至恒重，用镊子夹取如干燥器中冷却，于分析天平上称重（W1），精确至小数后4位，得细胞干重为W1-W0。
取同一发酵液，稀释2、5、10、20、50倍，于600nm下测OD值。
以0D值为纵坐标，菌液浓度（g/L）为横坐标，绘制标准曲线。
均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光光度计上测定A600，根据菌体浓度与吸光度之间关系地标准曲线换算出菌体浓度。
其余发酵液于3℃，2000r/min条件下离心分离8min,上清液装入编号三角瓶，用于测糖。
（2）测定葡萄糖
样品处理：
用蒸馏水对样品液进行稀释待用。
标定碱性酒石酸铜溶液：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL（甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。
样品溶液预标定：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。
样品溶液测定：
分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的样品溶液，使在2min内加热至沸腾，趁沸继续以每两秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。
结果计算：
，式中：
c——葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；
V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL；
V1——测定时平均消耗样品溶液体积，mL；
N——被测样品稀释倍数。
6.放罐
（1）发酵8小时后，测OD值及还原糖量，当发酵液的PH不断上升且为碱性、OD值增长缓慢，且还原糖量很低时，可判断发酵结束，准备放罐。
（2）放罐操作同取样。
将全部发酵液取出后，100℃煮沸10分钟灭菌，灭完菌的发酵液可排放入下水道。
7.清洗
（1）放罐完毕后，打开自来水进水口，往发酵罐中注满水，同时开动搅拌轴搅动清洗五分钟，排水。
（2）再次注入自来水清洗，操作如1。
（3）清洗结束，关闭电源。
二、实验结果与分析
1.发酵过程数据结果
⑴每小时记录发酵过程温度、PH值、DO、通风、转速的测定数值，结果如下表：
时间
发酵时间h
温度℃
pH值
DO
%
通风L/min
转速
r/min
消泡
取样mL
值班人
空白
37.0
7.00
100.0
2-3
300
250
8:
20
95.0
50
9:
1
36.9
6.94
76.1
10:
2
6.93
26.7
11:
3
6.95
30.1
12:
4
6.97
8.7
13:
5
6.98
5.7
14:
6
6.99
0.6
15:
7
7.36
1.4
16:
8
7.59
7.0
17:
9
⑵大肠杆菌标准曲线绘制如下所示：
两者的关系曲线图1，如下图：
图1菌液OD值与干菌体浓度关系图
得大肠杆菌干菌体浓度X与菌液OD值y之间的关系为：
y=1.1658X+0.0989
则X=（y-0.0989）/1.1658
⑶测定不同时间发酵液的OD值，确定对应时间的菌液浓度，结果如下表：
表3发酵液OD值与菌液浓度关系表
样品
稀释度
OD值
X=（y-0.0989）/1.1658
干菌体浓度
空白对照
0.628
0.454
0.845
0.064
0.640
2.2
0.98
0.756
1.663
6.6
0.949
0.729
4.813
18
0.869
0.661
11.890
30
0.855
0.649
19.457
55
0.795
0.597
32.841
66
0.777
0.582
38.390
0.564
37.201
0.748
0.557
36.748
⑷测定不同时间发酵液的葡萄糖浓度，结果如下表：
表4培养液中葡萄糖含量表
编号
稀释倍速
预测X0
测定X1
测定X2
测定X3
平均体积
葡萄糖浓度
标定
10.80
10.90
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