附录基因工程操作中常用的溶液和缓冲液生物学试验教学中心Word文档格式.docx
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840.5mLH2O;
159.5mL乙酸。
甲酸(HCOOH,分子量46.02,重量百分比90%),1mol/L
957.3mLH2O;
42.7mL甲酸。
高氯酸(HClO4,分子量100.5,重量百分比70%),1mol/L
914.5mLH2O;
85.5mL高氯酸。
氢氧化钾(KOH,分子量56.1),1mol/L
56.0gKOH溶解于1LH2O中。
氢氧化钠(NaOH,分子量40.0),1mol/L
将40.0gNaOH溶解于450mLH2O中,补加H2O至1L。
氢氧化钠(NaOH,分子量40.0),10mol/L
将400gNaOH溶于450mL水中,补加H2O至1L。
氨水(NH4OH,分子量35.0,重量百分比25%),1mol/L
924.9mLH2O;
75.1mL氨水。
尿素(CH4N2O,分子量60.06),8mol/L
分批将480.5g尿素溶解在600mL蒸馏水中,加H2O定容只至1L,过滤灭菌。
氯化钠(NaCl,分子量58.5),5mol/L
将292.5gNaCl溶于450mLH2O中,补加H2O至1L。
氯化钾(KCl,分子量74.5),1mol/L
将74.5gKCl溶于450mLH2O中,补加H2O定容至1L。
氯化镁(MgCl2,分子量203.3),1mol/L
将203.3gMgCl2·
6H2O溶于450mLH2O中,加H2O至1L,高压灭菌。
硫酸镁(MgSO4,分子量246.5),1mol/L
将246.5gMgSO4·
7H2O溶于450mLH2O中,加H2O至1L。
氯化钙(CaCl2,分子量147.0或219.1),1mol/L
将147.0gCaCl2·
2H2O溶于450mLH2O中,加H2O至1L,
或将219.1gCaCl2·
6H2O溶于450mLH2O中,加H2O至1L。
二、各种常见缓冲液和平衡盐的配制
10%SDS(十二烷基硫酸钠盐):
称取100gSDS溶解在800mL水中,置68℃水浴中溶解,加数滴浓盐酸调pH到7.2,定容到1000mL,不需要消毒。
禽血DNA提取裂解液:
2mol/L尿素
100mmol/LTris·
HCl(pH8.0)
1%SDS
100mmol/LEDTA
现配现用,无需灭菌。
配制方法:
600mL蒸馏水中,顺序加入120.12g尿素,待溶解后加入100mL1mol/LTris(pH8.0),溶解后加入37.2gNa2EDTA·
2H2O,溶解后缓缓加入20%SDS50mL,定容至1000mL。
细菌DNA提取裂解液Ⅰ:
25mmol/LTris·
HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),50mmol/L葡萄糖,使用前加溶菌酶(2mg/mL)。
细菌DNA提取裂解液Ⅱ(碱-1%SDS):
1%(W/V)SDS溶解在0.2mol/LNaOH中。
酚(phenol):
(1)现在有商品酚可直接购买,但是要注意酚的pH值。
(2)酚的纯化和配制(提取核酸用的酚溶液):
如果购的酚不纯,例如市售酚含有杂质,常呈粉色或淡黄色,需要重蒸二次:
用前从冰箱中取出,在68℃水浴锅中溶解结晶酚,160℃左右蒸馏后,冷却至0℃,加入8-羟基喹啉(100g酚加0.1g8-羟基喹啉),酚变为黄色,8-羟基喹啉是抗氧化剂,并能部分抑制核糖核酸酶,含8-羟基喹啉的酚用等体积0.5mol/LTris-Cl(pH8.0)磁力搅拌器搅拌20min,约半小时后两相完全分开,用真空抽液器尽可能吸去上层水相,再加入等体积的0.1mol/LTris(pH8.0)至酚中,搅拌20min,再吸去上层水相,反复数次,至酚相pH值大于7.8,加入0.2%β-巯基乙醇和0.1mol/LTris(pH8.0)分装在棕色瓶中,此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存1个月,纯化和配制酚溶液都要戴手套,以免损伤皮肤。
酚—氯仿—异戊醇:
酚、氯仿和异戊醇按25∶24∶1(V/V)混合而成,加终浓度为0.1%的8-羟基喹啉,上面覆盖一层1cm厚的0.1mol/LTris(pH8.0),分成几份储存于-20℃,超过6个月则废弃。
它用来除去核酸中的蛋白质,异戊醇能消泡沫,有利于水相和有机相分开,氯仿—异戊醇混合液密闭瓶中保存。
Tris-Cl[Tris(三羟甲基氨基甲烷)],1mol/L
在800mL水中溶解121.1gTris,常温下用浓盐酸调至所需的pH值,常用pH7.4,或pH8.0,混匀后加水定容至1L,高压灭菌。
要获得所需的某一特定pH的0.1mol/LTris·
HCl缓冲液的配制,可通过将一定数量的0.1mol/LHCl和100mL0.1mol/LTris溶液混合,如下表附-1所示:
表附-1特定pH的0.1mol/LTris·
HCl缓冲液的配制所需的0.1mol/LHCl的毫升数
pH(25℃)
1.1mol/L
HCl(mL)
0.1mol/L
7.2
89.4
7.8
69.0
8.4
34.4
7.3
86.8
7.9
64.0
8.5
29.4
7.4
84.0
8.0
58.4
8.6
24.8
7.5
80.6
8.1
52.4
8.7
20.6
7.6
77.0
8.2
45.8
8.8
17.0
7.7
73.2
8.3
39.8
8.9
14.0
注意:
Tris缓冲液的pH值随温度变化较大,每1℃可引起大约0.028pH单位的变化。
Tris缓冲液的pH值应调校至待使用温度下的pH值。
因为Tris的pKa值为8.08,因此Tris不应该在大约pH7.2以下和pH9.0以上用作缓冲液。
Tris·
HCl,pH6.8,4×
:
在40mLH2O中溶解6.05gTris(0.5mol/L),用1mol/LHCl调至pH6.8,补加H2O至整体积100mL,用0.45µ
m滤膜过滤溶液后于4℃可保存1个月。
Tris•HCl,pH8.8,8×
在300mLH2O中溶解182gTris(3mol/L),用1mol/LHCl调至pH8.8,补加H2O至整体积500mL,用0.45µ
Tris•HCl/SDS,pH8.8,4×
在300mLH2O中溶解91gTris(1.5mol/L),用1mol/LHCl调至pH8.8,补加H2O至总体积500mL,用0.45µ
m滤膜过滤溶液,再加入2gSDS[0.4%(W/V)],于4℃可保存1个月。
Tris•HCl/SDS,pH6.8,8×
在40mLH2O中溶解6.05gTris(0.5mol/L),用1mol/LHCl调至pH6.8,补加H2O至总体积100mL,用0.45µ
m滤膜过滤溶液,再加入0.4gSDS[0.4%(W/V)],于4℃可保存1个月。
Tris•HCl/SDS,pH8.45:
在300mLH2O中溶解182gTris(3.0mol/L),用1mol/LHCl调至pH8.45,补加H2O至总体积500mL。
用0.45µ
m滤膜过滤溶液,再加入1.5gSDS[0.3%(W/V),于4℃可保存1个月。
MOPS(3-吗啉代丙磺酸,分子量209.3)电泳缓冲液,10×
0.4mol/LMOPS,pH7.0
0.5mol/LNaAc
0.01mol/LEDTA
HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸),分子量238.3)缓冲盐水(HeBS):
137mmol/LNaCl
5mmol/LKCl
0.7mmol/LNa2HPO4
6mmol/L葡萄糖
21mmol/LHEPES
调至pH7.05;
因为这是一个关键参数,因此应仔细检测。
HEPES缓冲盐水(HeBS),2×
16.4gNaCl(0.283mol/L),0.2gNa2HPO4(1.5mmol/L)
11.9gHEPES酸(0.023mol/L)加H2O至1L
用5mol/LNaOH调至pH7.05(精确的pH值对有效的转染特别重要),过滤除菌。
许多研究者常配制大量的2×
HeBS,对溶液的转染效率进行检测后将其等量分装成50mL一份冻存。
从两批2×
HeBS溶液获得的转染效率可能有较大的差异。
每一批新鲜配制的溶液都要检查其转染效率。
通过将0.5mL2×
HeBS与0.5mL250mmol/LCaCl2溶液混合并旋涡振荡可快速检测2×
HeBS溶液的转染效率。
在显微镜下即可很快观测到微小的沉淀形成。
溶液的转染效率必须一直检查,但如果在检查时溶液中不形成沉淀,这可能发生了某种错误。
Hanks平衡盐溶液(HBss):
5.4mmol/LKCl
0.3mmol/LNa2HPO4
0.4mmol/LKH2PO4
4.2mmol/LNaHCO3
1.3mmol/LCaCl2
0.5mmol/LMgCl2
0.6mmol/LMgSO4
5.6mmol/LD-葡萄糖
0.02%(W/V)酚红(可选)
加H2O至1L并调pH至7.4
HBss可从Biofluids或Whittaker公司购买。
不含CaCl2和MgCl2的HBss可配制或购买。
其中可选用的成分通常对实验并无影响,但它们的出现可能对某一过程有损害。
针对单个的方案,决定是否使用这些成分并在“材料”栏中进行了推荐。
TE缓冲液,pH7.4,7.5,或8.0:
10mmol/LTris·
HCl,pH7.4,7.5,或8.0
1mmol/LEDTA,pH8.0
TAE(Tris-乙酸)电泳缓冲液:
50×
贮存液,pH约8.5:
242gTris碱
57.1mL冰醋酸
37.2gNa2EDTA·
2H2O
加H2O至1L
1×
工作液:
40mmol/LTris·
Ac
2