截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文Word下载.docx

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1.1.5发酵产物的分离提取3

1.2截短侧耳素国内外研究现状4

1.2.1截短侧耳素简介4

1.2.2截短侧耳素的结构与活性4

1.2.3截短侧耳素产生菌及其选育6

1.2.4截短侧耳素的发酵7

1.2.5截短侧耳素的提取8

1.3重离子辐照微生物育种9

1.3.1重离子加速器与重离子束概述9

1.3.2重离子辐照在微生物育种中的应用11

1.4微生物发酵过程优化与响应面法实验设计12

1.5高通量技术与微生物筛选14

1.5.1高通量技术概述14

1.5.2高通量技术在微生物育种中的应用15

1.6本研究的主要内容与意义17

第2章重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌18

2.1材料与方法18

2.1.1菌种18

2.1.2仪器18

2.1.3培养基与培养方法18

2.1.3辐照样品的处理19

2.1.4辐照方法及剂量的选择19

2.1.5菌种的保藏19

2.1.6辐照诱变后致死率和致死剂量的确定19

2.1.7截短侧耳素含量测定方法19

2.2结果与分析20

2.2.1贯穿辐照截短侧耳素产生菌的致死率20

2.2.2注入辐照截短侧耳素产生菌的致死率与致死剂量21

2.2.3注入辐照后存活菌株的正突变率21

2.2.4注入辐照诱变高产菌株的筛选22

2.3讨论23

第3章截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化24

3.1材料与方法24

3.1.1菌种24

3.1.2培养基配方24

3.1.3仪器24

3.1.4产量分析方法24

3.2结果与分析25

3.2.1主要影响因素的确定25

3.2.2最佳发酵培养基的确定27

3.2.3优化培养基的验证29

3.3讨论29

第4章截短侧耳素高产菌高通量筛选方法的建立30

4.1材料与方法30

4.1.1菌种与培养30

4.1.2试剂与仪器30

4.1.3高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量31

4.1.4特征波长的确定31

4.1.5高通量测定方法标准曲线的绘制32

4.1.6常规发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定32

4.1.7高通量固体发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定32

4.1.8统计分析方法32

4.2结果与分析32

4.2.1高效液相色谱法中截短侧耳素标准曲线的绘制结果32

4.2.2Clitopiluspasseckerianus高通量固体发酵与常规发酵的比较33

4.2.3紫外检测方法特征波长34

4.2.4高通量检测方法的标准曲线35

4.2.5高通量检测方法的精密度35

4.2.6高通量检测与常规检测的比较36

4.2.7高通量筛选与常规筛选的比较37

4.2.8高产菌株产量的稳定性39

4.3讨论39

结论与展望41

参考文献43

致谢46

附录（硕士期间发表论文）47

摘要

截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等真菌担子菌Clitopiluspasseckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。

以截短侧耳素为起点人工合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。

原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。

选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。

前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopiluspasseckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用。

优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。

截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。

基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下：

1.重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌

兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。

本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。

得到了碳离子诱变Clitopiluspasseckerianus的最适诱变方式和最适剂量为离子注入辐照40Gy，为进一步利用碳离子辐照诱变Clitopiluspasseckerianus提供了一定的理论依据，并筛选出一株截短侧耳素高产菌株K40-3，摇瓶效价达到16120μg/mL，较出发菌株提高25.3%。

2.截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化

本研究利用响应面法对碳离子辐照诱变后筛选得到的高产菌株K40-3进行了摇瓶发酵条件优化，并借助于SAS软件进行试验设计与数据分析，得到的最佳发酵条件为葡萄糖5.0%、大豆油0.33%、酵母粉0.6%、玉米浆3.0%、MgSO40.035%、CaCO30.05%、初始pH6.9、装量35mL/500mL△，截短侧耳素效价达到24750μg/mL，在初始发酵条件的基础上提高了53.7%。

3.高通量截短侧耳素产生菌筛选方法的建立

近年来发展起来的高通量技术，由于具有微型化、高效化、低廉化的各种特点，非常适合应用于高产菌株的筛选。

前人在高通量筛选菌株的研究中已做了大量的工作，建立了多种工业微生物微量培养和高通量产物检测方法，但并没有适合于Clitopiluspasseckerianus的微量培养方法与产物快速检测方法。

本研究成功建立了截短侧耳素产生菌Clitopiluspasseckerianus的微量固体发酵方法和高通量效价检测方法，二者结合筛选截短侧耳素高产菌株，可以快速测定一批待测菌株的效价，替代常规摇瓶发酵菌种筛选，可大大提高截短侧耳素产生菌的育种效率，为截短侧耳素产生菌的进一步菌种筛选工作奠定了良好的基础。

关键字：

截短侧耳素；

重离子辐照；

响应面法优化；

高通量筛选

Abstract

Pleuromutilinisakindofdoubleterpenoidantibioticfromfungal,Clitopiluspasseckerianus.Itisanactivesubstanceagainstpenicillin-streptomycin-resistantstaphylococci.Pleuromutilinclassantibioticshaveexcellentantibacterialactivityandtheyareknownasapowerfulweapontofightagainstdrug-resistant.Thebenefitsofthepleuromutilindevelopmentareobvious;

therearemanyantibioticsofpleuromutilinclasslistedintheallstudystages.Sothedemandforthepleuromutilinantibioticswillincrease.Andtheproductionofpleuromutilinslowedthedevelopmentspeedofpleuromutilinclassantibiotics.Inthisstudy,pleuromutilin-productstrainisimproved.

Themattersmustbeconsideredinthebreedingofhigh-productionstrainsarethemethodofmutagenicity,theoptimizationoffermentation,themethodofscreening.Previoususedavarietyofmutagenesismethodstobreedhigh-yieldstrains,butClitopiluspasseckerianusisakindoffungianditsabilitytorepairitselfisgood,generalmutagenisnotsuitableforitsbreeding.Tooptimizethepleuromutilinfermentationconditions,previoususedsingle-factortestororthogonaltest.Thenumberoftrialsislarge,andtheresultswereunabletofindthebestcombinationoffactorlevels.Thebreedingofpleuromutilinhigh-productionstrainistime-consumingandheavyworkload,whichlimitsthedevelopmentofpleuromutilin.Themethodofquickscreeningisinurgentneed.Then,themethodsofthisstudyare:

1.HeavyIonIrradiationbreedingpleuromutilin-productionstrain.

Becauseofthehighenergy,strongmutageniceffects,andthemutationcannotberepaired,theheavyionbeamgeneratedbyHIRFLinInstituteofModernPhysics,ChineseAcademyofSciencesenergy,isusedinthemicrobialmutagenesismoreandmore,andtheresultsaregood.Inthisstudy,heavyionirradiationbreedingmethodsisusedtobreedClitopiluspasseckerianusforhigh-productionstrains.Theoptimumdoseofionimplantationirradiationis40Gy.Andahigh-productionstrainK40-3isobtained.TheproductionofK40-3is16120μg/mL,increasedby25.3%.

2.ResponseSurfaceMet