截短侧耳素高产菌株重离子诱变及高通量筛选毕业论文Word下载.docx

1、1.1.5发酵产物的分离提取 31.2 截短侧耳素国内外研究现状 41.2.1截短侧耳素简介 41.2.2截短侧耳素的结构与活性 41.2.3截短侧耳素产生菌及其选育 61.2.4截短侧耳素的发酵 71.2.5截短侧耳素的提取 81.3 重离子辐照微生物育种 91.3.1重离子加速器与重离子束概述 91.3.2重离子辐照在微生物育种中的应用 111.4 微生物发酵过程优化与响应面法实验设计 121.5 高通量技术与微生物筛选 141.5.1高通量技术概述 141.5.2高通量技术在微生物育种中的应用 151.6 本研究的主要内容与意义 17第2章 重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌 182.1 材

2、料与方法 182.1.1菌种 182.1.2仪器 182.1.3培养基与培养方法 182.1.3辐照样品的处理 192.1.4辐照方法及剂量的选择 192.1.5菌种的保藏 192.1.6辐照诱变后致死率和致死剂量的确定 192.1.7截短侧耳素含量测定方法 192.2 结果与分析 202.2.1贯穿辐照截短侧耳素产生菌的致死率 202.2.2注入辐照截短侧耳素产生菌的致死率与致死剂量 212.2.3注入辐照后存活菌株的正突变率 212.2.4注入辐照诱变高产菌株的筛选 222.3 讨论 23第3章 截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化 243.1材料与方法 243.1.1菌种 243.1.

3、2培养基配方 243.1.3仪器 243.1.4产量分析方法 243.2结果与分析 253.2.1主要影响因素的确定 253.2.2最佳发酵培养基的确定 273.2.3优化培养基的验证 293.3讨论 29第4章 截短侧耳素高产菌高通量筛选方法的建立 304.1 材料与方法 304.1.1菌种与培养 304.1.2试剂与仪器 304.1.3高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量 314.1.4特征波长的确定 314.1.5高通量测定方法标准曲线的绘制 324.1.6常规发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定 324.1.7高通量固体发酵方法中发酵产物的提取与截短侧耳素含量的测定 3

4、24.1.8统计分析方法 324.2 结果与分析 324.2.1高效液相色谱法中截短侧耳素标准曲线的绘制结果 324.2.2Clitopilus passeckerianus高通量固体发酵与常规发酵的比较 334.2.3紫外检测方法特征波长 344.2.4高通量检测方法的标准曲线 354.2.5高通量检测方法的精密度 354.2.6高通量检测与常规检测的比较 364.2.7高通量筛选与常规筛选的比较 374.2.8高产菌株产量的稳定性 394.3讨论 39结 论 与 展 望 41参 考 文 献 43致 谢 46附录（硕士期间发表论文） 47摘 要截短侧耳素（pleuromutilin）是由高等

5、真菌担子菌Clitopilus passeckerianus产生的一种二萜烯类抗生素，对青霉素-链霉素抗性葡萄球菌具有抑制作用。以截短侧耳素为起点人工合成的一系列截短侧耳素类抗生素具有优越的抗菌活性，人们认为它是对抗耐药菌的有力武器，极具研究价值，许多新型的截短侧耳素类抗生素正处在研发上市的各个阶段，因此截短侧耳素类抗生素的国内外需求量不断增大。原料药截短侧耳素的产量制约着截短侧耳素类抗生素发展，因此本研究对截短侧耳素产生菌进行了高产菌株的诱变选育。选育高产菌株，必须考虑的因素有三个，诱变方法、发酵优化、筛选方法。前人使用了多种诱变方法选育截短侧耳素高产菌株，但Clitopilus passe

6、ckerianus为高等真菌，修复能力强，一般诱变剂不能对其达到良好的诱变作用。优化截短侧耳素发酵条件，前人多采用单因子试验或者正交试验，试验次数多，且无法找到最佳因素水平组合。截短侧耳素产生菌筛选耗时长，工作量大，是阻碍其应用发展的重要因素，急待建立快速筛选方法。基于以上原因，本研究的主要方法与结果如下：1. 重离子辐照诱变截短侧耳素产生菌兰州近代物理研究所重离子加速器产生的重离子束由于能量大，诱变作用强，突变不易修复的特点，越来越多的应用于微生物的诱变，并取得了良好的效果。本研究首次利用重离子辐照对截短侧耳素产生菌进行诱变，并筛选高产菌株。得到了碳离子诱变Clitopilus passec

7、kerianus的最适诱变方式和最适剂量为离子注入辐照40Gy，为进一步利用碳离子辐照诱变Clitopilus passeckerianus提供了一定的理论依据，并筛选出一株截短侧耳素高产菌株K40-3，摇瓶效价达到16120g/mL，较出发菌株提高25.3%。2. 截短侧耳素产生菌发酵条件的响应面法优化本研究利用响应面法对碳离子辐照诱变后筛选得到的高产菌株K40-3进行了摇瓶发酵条件优化，并借助于SAS软件进行试验设计与数据分析，得到的最佳发酵条件为葡萄糖5.0%、大豆油0.33%、酵母粉0.6%、玉米浆3.0%、MgSO40.035%、CaCO30.05%、初始pH6.9、装量35mL/5

8、00mL，截短侧耳素效价达到24750g/mL，在初始发酵条件的基础上提高了53.7%。3. 高通量截短侧耳素产生菌筛选方法的建立近年来发展起来的高通量技术，由于具有微型化、高效化、低廉化的各种特点，非常适合应用于高产菌株的筛选。前人在高通量筛选菌株的研究中已做了大量的工作，建立了多种工业微生物微量培养和高通量产物检测方法，但并没有适合于Clitopilus passeckerianus的微量培养方法与产物快速检测方法。本研究成功建立了截短侧耳素产生菌Clitopilus passeckerianus的微量固体发酵方法和高通量效价检测方法，二者结合筛选截短侧耳素高产菌株，可以快速测定一批待测菌

9、株的效价，替代常规摇瓶发酵菌种筛选，可大大提高截短侧耳素产生菌的育种效率，为截短侧耳素产生菌的进一步菌种筛选工作奠定了良好的基础。关键字：截短侧耳素；重离子辐照；响应面法优化；高通量筛选AbstractPleuromutilin is a kind of double terpenoid antibiotic from fungal, Clitopilus passeckerianus. It is an active substance against penicillin-streptomycin-resistant staphylococci. Pleuromutilin class a

10、ntibiotics have excellent antibacterial activity and they are known as a powerful weapon to fight against drug-resistant. The benefits of the pleuromutilin development are obvious; there are many antibiotics of pleuromutilin class listed in the all study stages. So the demand for the pleuromutilin a

11、ntibiotics will increase. And the production of pleuromutilin slowed the development speed of pleuromutilin class antibiotics. In this study, pleuromutilin-product strain is improved.The matters must be considered in the breeding of high-production strains are the method of mutagenicity, the optimiz

12、ation of fermentation, the method of screening. Previous used a variety of mutagenesis methods to breed high-yield strains, but Clitopilus passeckerianus is a kind of fungi and its ability to repair itself is good, general mutagen is not suitable for its breeding. To optimize the pleuromutilin ferme

13、ntation conditions, previous used single-factor test or orthogonal test. The number of trials is large, and the results were unable to find the best combination of factor levels. The breeding of pleuromutilin high-production strain is time-consuming and heavy workload, which limits the development o

14、f pleuromutilin. The method of quick screening is in urgent need. Then, the methods of this study are: 1. Heavy Ion Irradiation breeding pleuromutilin-production strain. Because of the high energy, strong mutagenic effects, and the mutation cannot be repaired, the heavy ion beam generated by HIRFL i

15、n Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences energy, is used in the microbial mutagenesis more and more, and the results are good. In this study, heavy ion irradiation breeding methods is used to breed Clitopilus passeckerianus for high-production strains. The optimum dose of ion implantation irradiation is 40Gy. And a high-production strain K40-3 is obtained. The production of K40-3 is 16120g/mL, increased by 25.3%.2. Response Surface Met