感冒清胶囊微生物限度检查方法验证设计Word文档下载推荐.docx

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微生物限度检查是药物安全性研究的重要组成部分，由于中药剂型成分复杂，其中任何药材成分的抑菌作用都可能影响微生物限度检查的准确性，因此通过验证试验来确定采用的微生物检查方法的准确性是十分有必要的。

本课题以感冒清胶囊中成药品种为研究对象，结合药品处方和工艺的特点，阐述中成药微生物限度检查的四种方法（常规法、培养基稀释法、离心沉淀法和薄膜过滤法）中常规法的特点和操作步骤，同时对其适用性以及影响因素进行考察。

关键词：

微生物限度检查；

中成药；

常规法。

第一章前言

药品是一种关乎人类身体健康的特殊商品，一生中从不使用药品的人是凤毛麟角的。

普罗大众从生命孕育到牛命终结，都少不了和药品打交道，而且几乎都是用于治病甚至是救命的。

因此，药品质量的重要性不言而喻。

在药品质量控制的范畴里，除了确保其有效性以外，安全性的控制更应具有特殊意义。

否则，治病的药品就会变成致病，甚至是致命的“毒药”。

药品的安全性除了应从处方和原料的筛选方面严格把关以外，防止污染的问题也是至关重要的，这其中也包括了微生物污染的问题，药品染菌对使用者具有潜在的、不可预测的危害。

事实上，由于药品染菌引起使用者感染以至造成严重后果的事件屡有报道。

20世纪60年代，瑞典从匈牙利、丹麦进口了一批甲状腺粉，由于污染了沙门菌，结果先后引起237人罹患沙门菌病。

这方面还有更多的例证，例如由于滴眼剂污染铜绿假单胞菌，导致病人发生角膜溃疡的事例、因使用污染破伤风梭菌的妇科用药引发破伤风症而死亡的事例、2006年导致11人死亡的“欣氟”事件、2008年导致云南省6名患者出现严重不良反应，其中死亡3例的“刺五加注射液”事件等等，都是由于微生物污染药品引起的。

另外，药品染菌还可引起产品的霉变、酸败等理化性质的改变，从而造成药品失效、变质，甚至产生毒素，严重危害药品使用者的健康[1]。

因此，药品的染菌程度检查和安全性评价应当得到人们的重视，而药品微生物检验就是药品染菌程度和安全性评价的重要技术手段之一。

中药是我国人民广泛使用的医药产品，并且已经走出了国门。

中药在中医临床理论和实践经验的指导下，在我国应用了几千年，对促进中华民族的繁衍和保证人民的健康作出了巨大贡献。

近年来随着科学技术的不断进步，中药确切的临床疗效和较低廉的价格越来越得到认可，使用的人群越来越多，但伴随而来中药的安全性比以往则更需要引起重视。

中药安全性问题究其来源是多方面的，主要与中药本身特性、应用环境、辨证论治、种植和炮制的管理、患者体质和药品受污染程度等相关[2]。

由于中药在药材种植、采集、炮制的过程中都有可能受到微生物的污染，因此在其质量检验中山大学硕士学位论文中成药中微生物限度检查的方法学研究中，进行有关微生物检验是保证其安全性的必要环节。

微生物检验分为强制性的无菌检查（要求不能检出）和非强制性的限度标准检查（允许有一定数量的菌，微生物限度）。

实践中，在中成药的使用上要求无菌的相对较少（即必须进行无菌检查的制剂所占比例不大），大部分中成药需要进行的是微生物限度检查。

1.1微生物限度标准在我国的发展

我国开展药品微生物检验始于1972年，至今已有三十多年的历史。

微生物限度标准也已颁布实施了三十年。

1978年国家卫生部、化工部、商业部联合颁发了我国第一个《药品卫生标准》[1][3]，该标准主要为中药和化学药，并按丸剂、片剂、散剂、冲剂及糖浆、合剂、水剂等剂型规定了微生物限度，包括细菌总数、霉菌总数的不同规定。

其中：

口服药品lg或lml不得检出大肠埃希菌、沙门菌；

外用药品lg或lml不得检出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；

口服药品不得检出活螨。

上世纪70年代中后期，国内先后在武汉、宜昌等地因使用中药散剂治疗宫颈糜烂发生了多起事故，经查证为药物污染破伤风梭菌所致。

在调查研究并积累大量数据后，1980年版的《药品卫生检验方法》增补了破伤风梭菌检查法，并对用于深部组织、创伤、溃疡及阴道的用药开始检查破伤风梭菌。

1986年卫生部颁发了经修改的《药品卫牛标准》，1989年又下达了《药品卫生标准补充规定和说明》。

这两个文件载有与国际上基本一致的微生物限度检查法和20个化学药品种的微生物限度标准，并收载于《中国药典》1990年版[4]第二增补本。

之后的《中国药典》1995年版[5]收载了微生物限度检查法，并对少数剂型收载了微生物限度，但大多数剂型仍未有微生物限度的规定。

在《中国药典》2000年版[6]中重新对丸剂、片剂、散剂、胶囊剂以及以含发酵类药材为原料的制剂修订了微生物限度标准。

未列入标准的剂型，则根据用药途径，参照同类剂型的微生物限度作了补充，如滴耳剂、滴鼻剂等。

2005年版的《中国药典》[7]根据用药途径又修订了药品微生物修订标准，同时新增订了方法验证以及含药材原粉、豆豉和神曲等发酵成分制剂的限度标准，不仅要控制细菌、霉菌和酵母菌数，而且要控制大肠菌群数，使我国药品微生物限度标准与国际标准实现接轨。

由此可见，药品的微生物检查是随着人们对药品污染问题认识的提高，在吸取了事故甚至是生命的教训后建立起来，并不断补充完善的药品质量控制科目，而且必将继续得到发展。

1.2微生物限度检查的主要内容

微生物限度检查主要包括染菌量的检查和控制菌的检查两个方面：

1.2.1定量检查

染菌量的检查测定单位重量（g）、单位容积（m1）和单位面积（cm2）药品中的细菌数及真菌数（霉菌和酵母菌数）。

1.2.1.1细菌数测定

药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的指标，也是检测中药药品质量的指标之一。

细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH值、培养温度和时间等）每lg、lml、10cm2供试品液经培养后所生长的菌落数。

按我国药典规定，细菌计数是在需氧的条件下，温度30～35℃，一般培养48小时，在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。

药品细菌数测定是活菌计数，最常用也是我国药典收载的使用的方法是平板法。

细菌计数以菌落数为单位，即cfu（colonyformingunits）。

1.2.1.2霉菌和酵母菌数测定

霉菌和酵母菌均属于真菌。

受到真菌污染的药品不仅可能导致变质，还可能因其产生的代谢物以及各种真菌毒素，使服用该药品的患者产生急性或慢性的中毒病症，有的真菌毒素甚至可导致或诱发癌症[8]。

霉菌及酵母菌测定的方法很多，最常用的是平板菌落计数法。

我国药典采用玫瑰红钠琼脂培养基进行各种制剂的霉菌和酵母菌计数测定，当制剂中含有蜂蜜和王浆时，需采用酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基进行酵母菌计数测定。

1.2.2控制菌的检查

测定单位重量（g）、单位容积（m1）和单位面积（cm2）药品中粪便污染的指示菌，如：

大肠埃希菌、大肠菌群、沙门氏菌，以及某些特定菌（包括：

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、活螨等），在样品中不得检出或不超过某限度。

《中国药典》的控制菌包括以下几种：

1.2.2.1大肠埃希菌

口服制剂、眼部给药制剂、鼻及呼吸道给药制剂以及直肠给药制剂都需要控制大肠埃希菌，每lg或lml或10cm2均不得检出。

该菌常作为粪便污染的指示菌，它是肠杆科系各族细菌中从各种温血动物的肠道检出率最高的菌种。

大肠埃希菌随粪便排出体外，在土壤和水中如未被裂解可存活数天，在沃土表层则可存活更长时间，有可能污染水、食品、药品等。

因而检查药品、食品、饮水、环境水中有无大肠埃希菌及数量多少，则可判断样品是否被粪便污染及受污染的程度。

中国药典采用MUG—Indole法[9][10]进行大肠埃希菌的检查。

1.2.2.2大肠菌群

大肠菌群是指在37℃生长时能发酵乳糖，24小时内产酸产气的革兰氏阴性、氧化酶阴性、需氧或厌氧的无芽孢杆菌。

它不仅包括埃希菌属中的某些细菌，还包括肠杆菌属、枸橼酸菌属及克雷伯菌属中的某些细菌[11]。

中国药典规定口服制剂中含药材原粉的以及含豆豉、神曲等发酵成分的都需检查大肠菌群。

大肠菌群不仅可指示大肠埃希菌等受外界环境影响较大的近期污染细菌是否存在，而且能反映如产气肠杆菌、阴沟肠杆菌等受外界影响较小的远期污染细菌是否存在。

我国药典采用MPN（MostProbableNumber）测定法检查大肠菌群。

1.2.2.3沙门氏菌

沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌。

沙门氏菌可以在环境中长期生存，有的可以存活数年，可通过人、畜、禽的粪便或与带菌者接触，直接或间接地污染药品原料、辅料等药品生产的各个环节，所以来源于动物的药品受污染的机率较高。

因此，药典规定，含动物组织（包括提取物）及动物类原材料（蜂蜜、王浆、动物角及阿胶除外）的口服制剂每10g或10ml不得检出沙门氏菌。

1.2.2.4金黄色葡萄球菌

葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，80％的化脓性感染由它引起。

广泛分布于自然界，也存在于人和动物皮肤及与外相通的腔道中。

葡萄球菌大部分是不致病的，但是人群中有20％"

-'

50％的人可携带致病性葡萄球菌。

[12]如金黄色葡萄球菌，可引起多种严重感染，通常作为革兰氏阳性菌的代表。

葡萄球菌属是无芽孢细菌中抵抗力最强的细菌，耐干燥，对多种消毒剂不敏感。

中国药典规定局部给药制剂，包括表皮或黏膜给药，耳、鼻及呼吸道吸入给药，阴道、尿道给药制剂都需检查金黄色葡萄球菌。

1.2.2.5铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌为假单胞菌属的模式菌，习惯称为绿脓杆菌。

本菌广泛分布于自然界中，对人和动物植物均可造成危害。

[12]目前，因为其污染药品引起药源性疾病和医疗事故的例子时有发生，所以加强对该菌的控制是必要的。

与金黄色葡萄球菌相似，中国药典规定局部给药制剂都需控制该菌。

本菌除在硝酸盐培养基以外都是专性好氧。

1.2.2.6梭菌

梭菌属是在自然界分布广泛的一类微生物，主要存在于土壤、海水和淡水的沉积物中。

人和家畜及昆虫的肠道内亦存在该类微生物，可随粪便排泄，污染土壤和水源。

本菌多数为腐物寄生菌，对环境的抵抗力极强[13]。

其芽孢体可耐高温及干燥，有些菌的芽孢体可在土壤中存活数十年。

本菌为革兰氏染色阳性菌，大多数为专性厌氧。

所以，培养时应注意严格控制环境中的含氧量。

中国药典对用于阴道和尿道的制剂进行梭菌检查时，采用生孢梭菌作为阳性对照菌。

1.3微生物限度检查的方法

微生物限度检查方法按其研究内容的不同，方法也不尽相同。

细菌数的检查方法有多种，如平皿法、薄膜过滤法、涂抹法、MPN法。

由于药品细菌数测定是活菌计数，所以最常用的是平皿法。

霉菌和酵母菌计数也采取相同的检查方法。

控制菌则根据所需检查菌种的不同而采取不同的检查方法。

然而无论具体的操作步骤有什么不同，对于含抑菌成分的原料或制剂，最先需要处理的是消除其抑菌作用。

这是由于药品本身可能含有抑菌作用的组成及防腐剂等组分，一般认为，这些组分在一定浓度下对微生物具有抑制或杀灭的作用，被抑制的微生物将因受到不同程度的损伤而可能影响检查的准确性[14]。

但在适合的pH、营养充足等合适的条件下，微生物可能复苏，从而危害人体健康。

微生物检测时，首先要进行供试品溶液的制备。

不同特性的供试品溶液，应采取不同的制备方法。

如水溶性供试品可直接加入稀释剂；

不溶于水的固体制剂采用匀浆或加混悬剂制成均匀的混悬液；

非水溶性油剂或软膏剂加入乳化剂使之成为均匀分散的乳浊液；

有抑菌成分的供试品加入消除抑菌成分的中和剂，以及采用离心沉淀和薄膜过滤等消除抑菌成分的方法等。

《中国药典》2010年版规定，细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外均采用平板菌落计数法（平皿法）。

该方法测定结果只反映在规定的条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、pH值和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

平板菌落计数法是活菌