CRISP原理Word文档格式.docx
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融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。
CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基因修复等。
CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。
其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点，起到多靶点调控的作用。
起源：
1、2007年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司，目前被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。
2、2013年，四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统，自此CRISPR技术红红火火的发展了起来，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。
3、2015年，蒙大拿州立大学的两位学者以“CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems”为题，介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。
其中BlakeWiedenheft就是当年加州大学伯克利分校JenniferDoudna研究组成员，他们曾于2010年破解了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4是一种存在于原核细胞的酶，它能够启动生成CRISPR衍生RNAs（crRNAs），这种小RNA分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。
CRISPR与RNAi的区别
目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列，是可以遗传的。
由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分，因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多，更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。
CRISPR/Cas9特点和缺点：
CRISPR/Cas9的优点是操作简单，对基因组的效率高。
需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的sgRNA即可，不需要对Cas9核酸酶进行改造。
它可对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。
1、操作简单，靶向精确性更高。
sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便，用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。
2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。
基因组编辑技术的一个缺点是脱靶效应，可能在靶点以外的地方切断DNA，产生indel。
CRISPR-Cas系统三个主要阶段
细菌和古细菌进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统，这一系统可以分成I-III三个类型，至少有11种不同的亚型：
从I-A到I-F，从II-A到II-C，以及III-A和III-B。
其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
不过尽管有这些不同，所有的CRISPR-Cas系统都通过三个主要阶段来完成功能：
采集，CRISPRRNA（crRNA）生物合成，靶向干扰。
阶段1：
外源DNA采集
外源核苷酸是通过Cas蛋白来识别的，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中，由重复序列隔开。
对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构（PAM，protospaceradjacentmotif）的区域。
一般protospacers连接在CRISPR位点的一端，并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制，牵引序列。
Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。
相关论文解析：
MultiplemechanismsforCRISPR–Casinhibitionbyanti-CRISPRproteins
研究人员确定了其中三种anti-CRISPR蛋白：
AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。
他们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究，证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。
有两个anti-CRISPR阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性，但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作，利用了空间或非空间抑制模式来做到这一点的。
第三种anti-CRISPR蛋白通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。
在体内，这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物，首次证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。
作者们认为，这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在其他的方式—蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。
新研究首次探讨了蛋白质抑制CRISPR–Cas系统的机制。
这些多样且不同的机制反映了病毒-宿主军备竞赛深层的进化根源。
这些已知和尚有待发现的Anti-CRISPR，将为认识和操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。
其中一个例子就是，新研究发现AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR–Cas系统转变为了一个基因调控因子。
由于除了破坏外源DNA，CRISPR–Cas系统来执行着各种功能，许多重要的功能有可能是由与CRISPR–Cas元件互作，由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。
生物谷推荐的英文原文SnapShot：
CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems
阶段2：
crRNA合成
CRISPRRNA生物合成在转录之后，生成初级转录产物：
pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。
CrRNAs导向序列两端是相邻重复序列区域，在I型和II型系统中，这种CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6或Cas5d）切割，切割位点位于重新序列。
许多I型系统的重新序列会出现多次，因此Cas6也需要稳定连接在crRNA3’端茎环上。
对于III型系统来说，Cas6则是短暂连接，crRNA3’端会进一步通过未知的酶处理。
II型系统中，CRISPRRNA加工过程则取决于反式作用crRNA（tracrRNA），tracrRNA包含一个重复序列的互补序列，这些双螺旋区域在Cas9出现时可以通过RNaseIII进行处理。
CRISPR-mediatedadaptiveimmunesystemsinbacteriaandarchaea.
这篇发表在Annu.Rev.Biochem.杂志上的文章十分重要，解析了crRNA合成过程，以及其后的靶向干扰中的几个重要步骤，此后也被多人引用。
DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering
张锋的这篇综述概述了CRISPR/Cas9作为一种平台技术的开发状况以及在基因组编辑方面的应用，也讨论了其存在的一些挑战，以及未来的创新之路。
阶段3：
靶向干扰
成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用Cas核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。
I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。
III型系统则不依赖于PAM作为识别序列，而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'
handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'
handle互补的序列），并阻止靶向切割。
Co-transcriptionalDNAandRNACleavageduringTypeIIICRISPR-CasImmunity
一些数据表明，当病毒入侵细菌细胞时，称作为III型CRISPR-Cas的这一机制会靶向病毒的DNA，阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。
但另外的一些实验表明，III型CRISPR-Cas只能通过切割病毒RNA来让病毒丧失能力。
洛克菲勒大学的研究人员他们检测了III型CRISPR-Cas对DNA和RNA的切割，结果发现了从前其他人没有得到过的一个关键成分，并发现CRISPR-Cas确实切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。
这种双交叉系统有一些优势。
许多的病毒整合到它们感染细胞的基因组中保持休眠状态，不会造成损伤。
事实上，这些病毒对于细菌可能是有益的，例如它们携带的毒素帮助了细菌促进自身生存。
举例说来，白喉毒素是由一种细菌所分泌，但编码这一毒素的基因却来自于一种病毒。
只有在病毒开始将它们的DNA转录为RNA之时才会让它们丧失功能，通过设置这样的要求III型CRISPR-Cas不会损及休眠病毒，使得它们可以继续让宿主细菌受益。
循环关闭
I型系统中，监测复合物中靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解（直接干扰）或最初采集，这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1和Cas2到外源DNA处，引起新
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