trizolLS试剂使用中文说明书Word下载.docx

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分离的蛋白质可以用于WesternBlots,recoveryofsomeenzymaticactivity,andsomeimmunoprecipitation.

注意：

TRIzolLS试剂适用于液体样品（如，血液和病毒制品）。

TRIzolLS试剂与TRIzol试剂仅在它们成分的含量上不同，TRIzolLS试剂的浓度更高，因此相对于同个样品时，TRIzolLS试剂需要量更少。

不要将未稀释的TRIzolLS试剂用于固体样品。

处理固体样品时，TRIzolLS试剂没有TRIzol试剂效果好，收率要低些。

警告

TRIzolLS试剂含有的成分具有毒、腐蚀性和刺激性，如果处理不慎会有危害健康。

请在通风橱里操作，并穿好实验服、戴好手套和安全眼镜。

避免直接接触TRIzolLS试剂，会导致皮肤、眼睛或者呼吸道等暴露部位的化学灼伤。

如果万一接触了皮肤或者眼睛，请立即用大量水冲洗15min，必要时去医院护理。

如果吸入了气体，立刻到通风地方呼吸新鲜空气，必要时去医院护理。

内容和贮存

TRIzolLS试剂有100ml和200ml两种规格的，室温运输和贮存。

妥善保管，1年内性质都很稳定。

使用目的

仅用于研究，不能用于人或动物的诊断或治疗。

需要材料

分离RNA、DNA和蛋白质还需要下列材料，但是我们未提供

分离RNA时，需要：

氯仿；

异丙醇；

75%乙醇（DEPC水处理过）；

无RNase水或者0.5%SDS；

能达到12,000*g的高速离心机；

聚丙烯微量离心管；

水浴槽（55-60℃）。

分离DNA时，需要：

100%乙醇；

75%乙醇；

0.1M柠檬酸钠（10%乙醇）；

8mMNaOH；

聚丙烯微量离心管。

分离蛋白质时，需要：

0.3M盐酸胍（95%乙醇）；

1%SDS；

样品准备

样品均质化

1.确定样品类型，在室温下如下表操作。

TRIzolLS试剂与样品的体积比为3:

1，一定要按指定的量加入TRIzolLS试剂，否则提取RNA会有DNA污染。

当样品少量（<

106细胞或者<

10mg组织）或者样品体积<

0.25mL，为方便提取RNA，需用无RNase水调整样品体积到0.25ml。

样品类型为生物液体时，操作步骤：

1.每0.25ml样品加入0.75mlTRIzolLS试剂；

2.移液器上下吹匀几次，使样品均匀。

污染物质含量高的生物液体（如，全血）应该先用无RNase水按1:

1稀释。

样品类型为组织时，操作步骤：

1.每50-100mg组织样品或者0.25ml组织悬液加入0.75mlTRIzolLS试剂；

2.高速搅拌器混匀样品。

采集样品后要立即处理和冷冻组织样品，不能处理未稀释的固体样品。

样品类型为单层贴壁细胞时，操作步骤：

1.吸出培养皿中的培养液；

2.每10cm2表面积的培养皿加入0.3-0.4mlTRIzolLS试剂,直接加到培养皿里细胞上；

3.移液器上下吹匀几次，在培养皿里直接裂解细胞。

不要在培养皿中加水混匀，粘附在皿上的残留培养液足够了。

样品类型为悬浮细胞时，操作步骤：

1.离心去除培养液获得细胞；

2.每0.25ml样品（来自动植物或者酵母细胞5-10*106，或者细菌细胞1*107）加入0.75mlTRIzolLS试剂；

加入TRIzolLS试剂之前切忌洗涤细胞，避免增加mRNA降解机率；

3.移液器上下吹匀几次，裂解细胞，对于酵母或者细菌细胞，可能还需要高速搅拌器来充分裂解。

2.（可选）当样品里脂肪、蛋白、多糖或者胞外物质（如，肌肉、脂肪组织或者块茎植物等材料），需要再加个分离步骤，移除样品里难溶物质。

如果你还需要回收样品里DNA，就不能做此步。

具体步骤：

1.混匀样品（如前面步骤1所述）后，4℃下，12,000*g离心样品10min；

离心后沉淀物质包含ECM、多糖和高分子量的DNA，RNA在上清液里，若样品富含脂肪，在上清液上面还有脂肪层；

2.移除覆盖的脂肪层；

3.将澄清的上清液移到新的离心管中。

3.进行相分离，或者储存已混匀的样品。

此样品能在室温放置几个小时，或者在-60到-70℃至少一个月。

相分离

1.室温静置已混匀样品（见混匀样品步骤）5min。

2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.2ml氯仿。

盖紧离心管的盖子。

3.使劲地手摇离心管15s。

4.室温静置2-15min。

5.4℃下，12,000*g离心样品15min。

混合物被分为3层，上层是澄清的水相，中间层，下层是红色的酚-氯仿相，只有RNA被排除在水相里。

上层水相体积约占TRIzolLS试剂最初体积的~70%。

6.倾斜离心管为45°

，小心地用移液器吸走水相，避免吸到中间层或者有机层。

7.将水相移到新的离心管，然后进行RNA分离步骤。

8.如果需要分离DNA和蛋白质，则保持中间层和酚-氯仿相有机层。

详见DNA分离步骤和蛋白质分离步骤。

有机相可在4℃保存过夜。

RNA分离步骤

当制备和处理RNA时，需要采取适当措施避免RNase污染。

RNA沉淀

1.（可选）当沉淀从少量样品（<

10mg组织）提取的RNA，需要添加5-10μg不含RNase的糖原作为水相的载体。

糖原是RNA的辅助沉淀剂，浓度≤4mg/ml时不会抑制第一链合成，也不会抑制PCR。

2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.5ml100%异丙醇到水相。

3.室温静置10min。

4.4℃下，12,000*g离心10min。

离心前，RNA通常看不见，离心后，在离心管底部和侧面可见丝状沉淀物。

5.进行RNA洗涤和重悬

RNA洗涤和重悬

1.移走离心管里上清液，只留RNA沉淀。

2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀。

涡旋，混匀样品。

3.4℃下，7500*g离心5min，弃上清液。

4.真空或者空气干燥RNA沉淀5-10min，不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。

不要让RNA沉淀干燥太彻底，否则RNA沉淀溶解度降低，会使A260/280<

1.6。

5.用无RNase水或者0.5%SDS（20-50μL）重悬RNA沉淀，移液器上下轻轻吹溶液几次。

如果要用于随后的酶反应中，就不要将RNA溶解在0.5%SDS里。

6.在水浴槽55-60℃孵育10-15min。

7.继续下游操作或者储存在-70℃。

DNA分离步骤

从相分离步骤中保存的中间层和酚-氯仿层提取DNA。

DNA沉淀

1.移走覆盖在中间层上的残留水相层，这是涉及到DNA提取质量的关键一步。

2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.3ml100%乙醇。

3.盖紧离心管，上下颠倒几次，混匀样品。

4.室温静置2-3min。

5.4℃，2000*g离心5min，沉淀DNA。

6.移走酚-氯仿层，如果需要提取蛋白质，则保留在新的离心管中。

该上清液可在-70℃下保存数月。

7.对DNA沉淀进行DNA洗涤和重悬。

DNA洗涤和重悬

1.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1ml柠檬酸钠/乙醇溶液（10%乙醇溶有0.1M柠檬酸钠，PH8.5）。

2.室温静置30min，不定时轻轻地上下倒置混匀。

DNA能在柠檬酸钠/乙醇溶液里保存2h。

3.4℃，2000*g离心5min，弃上清液。

4.再次洗涤（重复步骤1-3）。

当DNA沉淀较多（>

200μg）时，重复洗涤两次。

5.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1.5-2ml75%乙醇。

DNA样品在75%乙醇4℃能保存数月。

6.室温静置10-20min，不定时轻轻地上下倒置混匀。

7.4℃，2000*g离心5min，弃上清液。

8.真空或者空气干燥DNA沉淀5-10min，不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。

9.以0.2–0.3μg/μL浓度用8mMNaOH重悬DNA，每50-70mg组织或者1*107细胞加入8mMNaOH0.3-0.6mL。

我们高度建议用温和碱溶液重悬DNA，因为分离的DNA在水或者Tris缓冲液中重悬效果不好。

10.4℃，12,000*g离心10min，移走不溶物质。

11.将含DNA的上清液转移到新的离心管中，若需要，用HEPES调节PH，进行下游操作。

DNA能在4℃保存过夜，要想长期保存，则需用HEPES调节PH7-8，添加1mMEDTA，保存在4℃或者-20℃。

DNA和RNA产量测定

用RNA和DNA在260nm和280nm处的吸收值测定浓度。

预期产量

下表列出了各种来源材料提取RNA（A260/280>

1.8）和DNA（A260/280为1.6-1.8）的标准产量

蛋白分离步骤

从DNA沉淀步骤后留下来的酚-氯仿层分离蛋白质，蛋白质沉淀或者蛋白透析。

蛋白质沉淀

1.每1mlTRIzolLS试剂加入1.5ml异丙醇到酚-氯仿层。

2.室温静置10min。

3.4℃，12,000*g离心10min，保留沉淀的蛋白，弃上清液。

4.对蛋白沉淀进行蛋白洗涤。

蛋白洗涤

1.准备洗涤液，即：

0.3M盐酸胍溶于95%乙醇。

2.每1mlTRIzolLS试剂加入2ml洗涤液，洗涤蛋白沉淀。

3.室温静置20min。

蛋白样品可在0.3M盐酸胍-95%乙醇，4℃下保存一个月或者-20℃至少保存一年。

4.4℃，7500*g离心5min，弃洗涤液。

5.重复步骤2-4，两次。

6.洗涤3次后，加入2ml100%乙醇，涡旋。

7.室温静置20min。

8.4℃，7500*g离心5min，弃乙醇洗涤液。

9.空气干燥蛋白沉淀5-10min，不要干燥太彻底。

10.进行蛋白重悬步骤。

蛋白重悬

1.加1%SDS200μL,用移液管上下吹打直到蛋白重悬。

为了彻底溶液蛋白沉淀，可能需要将蛋白沉淀在水浴槽50℃孵育。

2.4℃，10,000*g离心10min，让不溶物质沉淀。

3.将含有蛋白