第八章mRNA剪接编辑PPT推荐.ppt

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核内不均一RNA，是mRNA的原初转录产物在核内形成的大小不等的中间物，相对分子质量大，也不均一，成为hnRNA。

hnRNA与mRNA的关系：

两者具有部分相同的序列；

两者都可以做翻译的模板；

两者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴；

两者都是由RNA聚合酶转录,hnRNP,hnRNP:

核糖核蛋白颗粒hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒（hnRNP），颗粒中蛋白质包围着hnRNA，这种hnRNA和蛋白质组成的复合物称为hnRNP。

1.mRNA加帽,帽子结构（m7GpppGp-）7-甲基鸟核苷三磷酸:

它由甲基化鸟苷酸经焦磷酸化与mRNA的5末端核苷酸相连，形成5,5-三磷酸连接（5,5-triphosphatelinkage），mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。

反应空间：

在mRNA的5-端加上m7GTP的结构。

此过程发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。

加工过程:

首先是在磷酸酶的作用下，将5-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。

加帽的顺序,当新生RNA链长度约为25nt时，其5端经修饰被加上一个7-甲基G，以5-5三磷酸连接。

RNA三磷酸酶（Triphosphatase）鸟苷酸转移酶（guanyltransferase）鸟嘌呤-7-甲基转移酶（guanosineethyltransferase）反应步骤如下：

核苷酸水解酶从RNA的5-端切掉基团；

鸟苷酸转移酶将来自GTP的GMP连接到RNA5-端的磷酸上，形成5-5三磷酸，释放出PPI甲基转移酶催化SAM的甲基转移到Cap-0的N7位。

CAP1:

OCH3,CAP2:

OCH3,CAP0,SAM,Step2,Step1,GMP,Step3,RNA三磷酸酶,鸟苷转移酶,帽子的类型,在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O类帽子（capO）；

在次末端核苷酸的核糖上的2-O位点上还有一个甲基位点的称1类帽子（cap1）；

此外，在第三个核苷酸的核糖上（2-O）有甲基化位点的称2类帽子（cap2）。

这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontednucleotidestructure）。

HNCH3,m7G,帽子0,mRNA5端的帽子位置和可被甲基化的位点,三种5帽结构形式,帽子结构的功能,有助于mRNA跨越核膜转运;

保护mRNA5不被酶降解；

使mRNA能与核糖体小亚基结合；

被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质合成;

提高剪接效率,2.PolyA尾巴,多聚腺苷化的信号及参与的蛋白因子,有效的信号是：

AAUAAA及随后的23-24nt的富GU区，再后的富U区。

参与的蛋白因子：

CPSF，CstF，CFI，CFII,加尾反应需要的顺式元件,3端添加多聚腺苷酸,长度：

20200nt加尾信号：

切割与加尾：

a.剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF）b.剪切刺激因子（cleavagestimulationfactor,CstF）c.剪切因子I，II（CFI，CFII）d.poly（A）多聚酶（polyadenylatepolymerase,PAP）e.poly（A）结合蛋白（poly（A）bindingprotein,PBP）,mRNA的多聚腺苷酸化过程,CPSF因子专一性与加尾信号AAUAAA结合CstF因子与富GU区结合CFI、CFII在加尾信号下游的1525nt处切割poly（A）多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加约10个腺苷酸，速度较慢poly（A）结合蛋白的结合加快多聚酶延伸速度，控制多聚腺嘌呤尾巴的长度,CPSF,PAP,PAPB,PolII的CTD促进切割,3端多聚腺苷酸尾巴的功能,提高mRNA的稳定性在核质转运中起作用提高mRNA的翻译效率影响最后一个内含子的切除创造终止密码子UGA选择性加尾调节基因的表达,3.RNA剪接（Splicing）,真核生物mRNA前体的剪接,mRNA前体的加工内容：

3.内含子的剪接1.5端添加帽子结构2.3端添加多聚腺苷酸,1.mRNA依赖snRNA的拼接2.选择拼接3.顺式和反式拼接4.I型自我拼接5.II型自我拼接,真核生物成熟mRNA形成的过程,断裂基因发现不久，Crick（1978年）提出了一系列发人深思的问题：

（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这种剪接酶是怎样识别RNA上特定的位点？

（2）剪切酶有没有特异性？

对不同的RNA是否需要不同的酶？

（3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？

切下的RNA的命运将如何？

Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有2个特点：

（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补；

（2）连接点具有很短的保守序列,亦称边界序列。

100种内含子的5端都是GU；

3端都是AG，因此称为GU-AG法则（GU-AGrule），又称为Chambon法则。

GU-AG法则,5splicesite（5剪接位点）:

theexon-intronboundaryatthe5endoftheintron3splicesite（3剪接位点）:

theexon-intronboundaryatthe3endoftheintronBranchpointsite（分枝位点）:

anAclosetothe3endoftheintron,whichisfollowedbyapolypyrimidinetract（Pytract）.,两个剪接位点的序列是不同的，左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。

GU-AG法则（GU-AGrule）不适用于线粒体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因,mRNA结构特点,边界序列:

其边界序列是完全符合GU-AG法则分枝点序列：

具有分枝点序列，位于内含子3端上游18-50nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。

内含子5端有一保守序列（5-GUAAGUA-3）可以和U1snRNA的5端的保守序列3-CAUUUCAU-5互补。

mRNA的剪接,转录产生的核内RNA前体分子与蛋白质结合，形成RNA和蛋白质组成的snRNP复合物（ribonucleo-proteinparticle）。

随着RNA链的延伸，每个内含子5和3两端的复合物成对联结，产生60S的颗粒剪接体（spliceosome），进行RNA前体分子的剪接。

细胞核中的小分子RNA称为细胞核小RNA（smallnuclearRNA,snRNA）;

位于细胞质中的称为细胞质小RNA（smallcytoplasmicRNA,scRNA）。

在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒（SnRNP和scRNP）的形式存在，俗称snurps和scyrps。

在核仁中也存在着一类小的RNA，称为核仁小RNA（smallnucleolarRNA,snoRNA）,它们在rRNA的加工中起作用。

snRNA参与剪接过程，并于其它蛋白一起构成一个大的颗粒复合体,称为剪接体（splicesome）。

Spliceosome（剪接体）,剪接过程由U1,U2,U4,U5,U6snRNPs催化，也有其他剪接因子的参与。

这些snRNPs中的RNA成分与5-和3剪接点及分支点的多种保守碱基配对。

Splicesome:

ThelargeRNA-proteinbodyonwhichsplicingofnuclearmRNAprecursorsoccurs.,剪接体中的snRNP的功能,U2和U6构成催化反应的核心,U5拉近相邻的2个外显子,U2snRNP可以与分支点序列配对,U6snRNP可以与5端剪接区域配对,真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图,由U1snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5剪接点，由结合在3剪接点上游富嘧啶区的U2AF（U2auxiliaryfactor）识别3剪接点并引导U2snRNP与分支点相结合，形成剪接前体（pre-spliceosome）。

剪接前体进一步与U4、U5、U6snRNP三聚体相结合，形成剪接体。

拼接体组装第一次转酯：

左外元、内元剪切套索第二次转酯：

exons连接、套索状内元释放拼接体（spliceosome）解体与套索（lariat）降解同步,ThesimplifiedmechanismofnuclearmRNAprecursor,Biochemicalstepsofpre-mRNAsplicing,acutismadeatthe5splicesite,separatingtheleftexonandtherightintron-exon.Therightintron-exonmoleculeformsalariat（套马索）,inwhichthe5-terminusoftheintronbecomeslinkedbya5-2bondtoabasewithintheintron.ThetargetbaseisanAinasequencethatiscalledthebranchsite.,Step1ofSplicing,Step1ofSplicing,Step2:

cuttingatthe3splicesitereleasesthefreeintroninlariatform,whiletherightexonisligated（spliced）totheleftexon.,U6与U2配对,催化转酯反应,U5拉近相邻外显子第2次转酯反应,哺乳动物细胞中mRNA前体上的snRNP是从5向下游“扫描”，选择在分支点富嘧啶区3下游的第一个AG作为剪接的3受点。

AG前一位核苷酸可以影响剪接效率，一般说来，CAG=UAGAAGGAG。

如果mRNA前体上同时存在几个AG，可能发生剪接竞争。

4.可变剪接ALTERNATIVESPLICING,背景,在高等真核生物个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行可变剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA。

脊椎动物中大约有5%的基因能以这种方式进行剪接，保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域，又具有特定的性质差异，进而拓展了基因所携带的遗传信息。

DrosophilaDSCAMgenecanbesplicedin38,000alternativeways,1