分子生物学实验手册Word文件下载.docx

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（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。

由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。

可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。

（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。

（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。

当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。

例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。

而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。

因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。

然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。

一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。

对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：

①流体静压；

②吸头润湿；

③流体动力学。

当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也必须注意。

流体静压：

在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取的液体过多。

如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。

吸头润湿：

当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。

对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。

对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。

流体动力学：

对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。

为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。

如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。

尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。

此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。

3注意事项

实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。

连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。

3.1取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。

3.2操作时要慢和稳。

3.3连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；

移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。

3.4连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

3.5吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。

3.6改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。

3.7发现吸头内有残液时必须更换。

3.8新吸头使用前应先预测。

3.9为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：

①压放按钮时保持平衡；

②加样器不得倒转；

③吸头中有液体时不可将加样器平放；

④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。

3.10勿用油脂等润滑活塞或密封圈。

3.11不可把容量计数调超其适用范围。

3.12液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。

3.13移液温度不得超过70℃。

3.14使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。

3.15连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

4.加样器的校准

加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测试方法。

这是目前用于此类仪器有效的校准方法。

4.1.适用加样器范围各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。

4.2.校准环境和用具要求

4.2.1室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。

4.2.2电子天平：

放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。

称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。

4.2.3小烧杯：

5-10ml体积。

4.2.4测定液体：

温度为20-25℃的去气双蒸水。

4.3.选定校准体积①拟校准体积；

②加样器标定体积的中间体积；

③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。

如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。

4.4.校准步骤

4.4.1将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。

4.4.2调节好天平。

4.4.3来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。

4.4.4垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。

4.4.5将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。

4.4.6将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。

4.4.7记录称量值。

4.4.8擦干吸头外面。

4.4.9按上述步骤称量10次。

4.4.10取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。

然后，按校准结果调节加样器。

4.5加样器的维护保养程序

加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：

4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。

清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。

4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。

4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。

4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。

4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：

压放按钮时保持平稳；

加样器不得倒转；

吸头中有液体时不可将加样器平放。

4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。

田士军

实验一PCR

一、实验原理：

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

二、设备：

微量移液器（10μl）；

离心机（Eppendorfcentrifuge541B）；

PCR仪（Bio-RadS10000TMThermalcycler）

三、耗材：

吸头，1.5ml，200μlPCR八连管，

四、试剂和配制方法：

上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水，Kit：

天根生化[2×

PfuMasterMixKp201（含有pfuDNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loadingbuffer）]。

五、步骤：

1．依次在管中加入：

（25μlPCR体系）按照kit的说明书：

Primer1（10uM）1μl

Primer2（10μM）1μl

2×

MasterMix12.5μl

ddH2O9.5μl

Template1μl

注：

空白对照不加模板；

其余先加ddH2O，最后加模板。

注意加样顺序：

ddH2O，Primer，2×

MasterMix，Template。

2．瞬离，将样品甩至管底。

3．PCR参数：

94℃5min

35×

（94℃25sec-60℃25sec-72℃30sec）

-72℃20min

（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72℃10min）若无需加A尾，只需72℃10min

4.立即电泳或保存于4℃

注意事项：

　　PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。

（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。

（2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。

　　超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；

移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

　　（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。

　　（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。

配制试剂用新器具，用后作一次性处理。

　　（5）试剂管用前先瞬时离