粗多糖含量测定方法学验证范本Word格式文档下载.docx
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西陇化学股份有限公司，分析纯，批号为1608021；
（3）蒽酮：
国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号为20131127；
（4）硫酸：
广州化学试剂厂，分析纯，批号为20150404-1；
（5）葡萄糖标准液：
标准称取干燥恒重的分析纯级葡萄糖0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀释100倍为使用液（0.1mg/ml）。
（6）0.1%蒽酮硫酸溶液（W/V）：
准确称取0.1g蒽酮置于烧杯中，缓缓加入100ml80%硫酸溶解，溶解后呈黄色透明溶液。
现用现配。
3、试样
（1）样品颗粒：
XXXXX有限公司提供。
二、方法的研究
粗多糖含量测定的方法来源于《保健食品功效成分检测方法》白鸿主编（中国中医药出版社）的第二法，本研究针对葡萄糖对照以及样品的的吸光度进行检测波长测定，如下所示：
1.检测波长的测定
取葡萄糖对照品溶液、样品溶液进行紫外光谱扫描，结果显示对照品和样品均在625nm波长附近有最大吸收。
序号
波长
吸光度
1
625.00
0.360
2
509.50
0.271
3
422.50
0.262
760.00
0.055
624.50
0.154
2.样品及对照制备方法
（1）样品提取：
称取混合均匀的固体样品2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加热1小时，冷却至室温后补加水至刻度（V1），混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀粗多糖。
（2）沉淀粗多糖：
准确吸取上滤液（或液体样品）5.0ml（V2），置于50ml离心管中（或2.0ml于15ml具塞离心管中），加入无水乙醇20ml（或8ml），混匀，于4℃冰箱静置4小时以上，以4000r/min离心5min，弃去上清液，残渣用80%（V/V）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次。
残渣用水溶解并定容至10ml（V3）。
（3）标准曲线的绘制：
准确吸取葡萄糖标准使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml（相当于葡萄糖0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg、0.12mg）置于10ml比色管中，补加水2.0ml，加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml，在旋涡混合器上混匀，置沸水浴中加热10min，取出，在流水中冷却20min后，用分光光度计在625nm波长处以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。
以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
（4）样品测定：
准确吸取样品待测液2.0ml（含糖量20—100μg），按标准曲线绘制步骤于625nm波长下测定吸光度值并求出样品含量。
三、方法学验证
1.线性
取适量葡萄糖对照品，精密称定，加水制成0.1094mg/ml的葡萄糖对照品储备溶液，分别精密吸取葡萄糖对照品储备溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml，置于10ml比色管中，补加水2.0ml，依法测定。
得标准曲线储备液。
依法测定，分别制成含葡萄糖为0、21.88μg、43.76μg、65.44μg、87.52μg、109.40μg、131.28μg的溶液，以吸光度（Y）为纵坐标，葡糖糖对照品的含量（X）为横坐标，绘制标准曲线，见下图，其回归方程为：
y=0.00507x+0.0048（r=0.99989），试验表明葡萄糖对照品在0～131.28μg范围内呈良好线性关系。
见表1。
表1线性考察结果
含量
（μg）
21.88
43.76
65.44
87.52
109.40
131.28
吸光度（Y）
-0.0007
0.1111
0.2209
0.3372
0.4431
0.5561
0.6635
回归方程
y=0.00507x+0.0048r=0.9999
粗多糖标准曲线如下：
粗多糖对照在0～131.28μg内成良好的线性关系。
2.精密度实验
取一供试品溶液，连续测定6次，记录吸光度，结果见表2。
试验结果RSD＜2.0％（RSD＝0.44％，n＝6），说明仪器精密度良好。
表2仪器精密度试验测定结果
平均吸光度
RSD％
0.3398
0.3418
0.44
0.3414
0.3407
4
0.3435
5
0.3436
6
0.3419
3.稳定性实验
取同一样品，按以下时间测定，记录吸光度，结果见表3。
表3粗多糖稳定性试验结果
时间
0min
30min
1h
2h
3h
4h
0.3437
0.3409
0.3397
0.3370
0.3342
03313
1hRSD（%）
0.60
2hRSD（%）
0.82
4hRSD（%）
1.35
结果表明供试品溶液在显色反应完成后4小时内稳定。
4.重复性试验
取同一供试品，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，并按样品及对照制备方法测定粗多糖含量，结果见表4。
表4粗多糖重复性试验测定结果（单位：
mg/100g）
样品编号
含量（mg/100ml）
348
343
335
330
338
平均含量
RSD（%）
1.91
结果表明6份供试品溶液按照粗多糖的检测方法测定重复性好。
5.中间精密度实验
取同一供试品（批号：
150401），由另一操作者于不同时间、不同仪器操作，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，并按样品及对照制备方法测定粗多糖含量，结果见表5。
表5粗多糖中间精密度试验测定结果（单位：
标准曲线结果：
20.32
40.64
60.96
81.28
101.6
121.92
0
0.098
0.196
0.296
0.394
0.506
0.575
y=0.0048x+0.0015r=0.9992
样品测定结果：
294
285
297
273
287
289
3.20
结果表明6份供试品溶液按照粗多糖的检测方法测定进行的中间精密度实验精密度良好。
6.准确度试验
采用加样回收法，精密称取本品（批号：
150401，平均含量：
338mg/100g，平均吸光度：
0.3449）2.0g各6份，按照样品及对照制备方法中制备得样品待测液6份，分别从6份待测液中吸取1ml置于10ml比色皿中，再分别精密加入1ml100%浓度的对照品溶液（浓度：
0.03402mg/ml），依法进行测定，记录吸光度，以吸光度计算回收率，结果见表6。
6份样品回收率均在95%~105%之间，平均回收率为103%，RSD=0.78%，该方法准确度符合要求。
表6粗多糖回收率试验结果
编号
取样量（g）
样品吸光度
对照品加入量
对照
加入对照后
回收率
平均值
（%）
RSD
（mg）
测得吸光度
总吸光度
2.0027
0.1724
0.03402
0.1688
0.3441
102
103
0.78
2.0030
0.1688
0.3463
2.0025
0.03402
0.3452
2.0020
0.3472
104
2.0034
0.3479
2.0029
0.3462
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