慢病毒载体构建步骤研究Word文档格式.docx
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U6和H1RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构（stemloop）。
在
siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链
互补结合形成siRNA；
也可由载体直接表达小发卡状RNA（smallhairpinRNA,shRNA）,载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可
折叠成具有1~4个U3'
突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
构建载体前
通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体（筛选）。
二、实验流程（大致的简单过程）
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的
病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细
胞（购入）中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到
基因组，从而高水平的表达效应分子。
大致的实验流程：
1.根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载
体；
（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）
2.对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
3.使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T细胞［1］，进行病毒包装和
生产，收集病毒液；
4.浓缩、纯化病毒液；
5.用高质量的病毒液感染细胞（293T细胞）；
6.通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western分析实验结果；
7.用高质量的病毒液感染宿主细胞；
检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药
物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
病
毒液足够用于一般的动物活体实验。
三、重组质粒构建流程
1.基因的获得：
shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中，退火形成双
链，PCR扩增）
2.回收
A.酶切产物的胶回收：
一般做50-100ul体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
B.PCR扩增产物的胶回收
原理：
首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光
下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化
柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附
核酸片段。
温水浴锅
试剂：
1、DNA回收试剂盒［2］2、50XTAE［3］（电泳缓冲液Tris-乙酸）3、ddH2O
4、琼脂糖凝胶［4］
步骤：
1）使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（分离DNA作用）［5］。
2）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖。
放入1.5ml离心管中。
3）按每100mg琼脂糖加入300—600卩溶胶液⑹的比例加入溶胶液（本实验加500ul）,置55C水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。
4）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体。
再将吸附柱放入同一个收集管中。
5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7）12000rpm室温空离心1分钟。
8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管（DNA）贮存于-20C。
9）琼脂糖凝胶电泳（鉴定作用）检测回收产物。
注意事项：
1）切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；
2）溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。
3）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。
4）把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率
3．连接
器材：
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。
T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddWater。
操作步骤：
PCR产物（已纯化回收）与T载体直接连接：
（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°
C。
（2）取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：
（需要调整）4ml目的基因；
1mlT载体；
0.5mlT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）；
1ml连接酶缓冲液10xbuffer；
3.5mlddWater，总量10ml体系。
（3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°
C干式恒温仪（或14°
C水中）中保温过夜（12-16h）。
（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°
C冰箱备用。
4.转化
原理：
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗
CaCl2溶液在低温（0C）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。
此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
在一定条件下，经过连接后的DNA片段与感受态
细胞混合保温，可以进入感受态细胞。
进入感受态细胞的DNA分子通过复制、表达，实现
遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。
目的：
连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然
后提取质粒。
器材：
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,
制冰机,分光光度计,微量移液枪。
1.LB固体和液体培养基[7]2.含特定抗生素的LB固体培养基3.100mMCaCI2溶液。
4.待转化质粒
大肠杆菌感受态细胞制备步骤：
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mILB液体培养基，37C振荡培养过夜（12h左右），直至对数生长期。
2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37C振荡培养2~3h,至OD600值达到0.5-0.6之间。
3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。
4）4C离心10min（4000r/min）
5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞，立即冰浴30min
7）4C离心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
9）分装细胞，200ul一份，4C保存。
暂且不用的贮存于-70C可保存半年。
取其中一
份进行转化。
质粒DNA的转化
1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
2）离心管放到42C水浴锅中保温90s（90s一定要精确，不要摇动试管）
3）将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min
4）每管加800ulLB液体培养基，37C培养1h
5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置30min
6）倒置平皿37C,12~16h，出现菌落
为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：
1.细胞生长状态和密度:
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
2.质粒的质量和浓度:
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。
一般
情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3•试剂的质量：
所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的（GR.或ARJ,并用超纯水配
制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4.防止杂菌和杂DNA的污染：
整个操作过程均应在无菌条件下进行。
5．抽提质粒（碱裂解法提取质粒DNA）
本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴
离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
1）用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA。
两种DNA在强碱环境都会变性。
2）当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值后，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA分子巨大，难以复性。
3）通过离心，大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀（SDS的作用下）除去，而质粒DNA留在上清中。
4）再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、
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