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温度控制在18°

4、10d~12d左右监测，检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检。

5、无氧、酸性抑制其它微生物生长。

三、注意事项

1、在发酵的过程中，随着酒精度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈红色

果醋

一、原理

醋酸菌，需氧，适温30℃-35℃，C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O+能量

或2CH3CHO+O2→2CH3COOH

二、实验步骤

1、当果酒制成以后，可以在发酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至30～35℃的条件下发酵，适时向发酵液中充气。

如果找不到醋酸菌菌种或醋曲，可尝试自然接种，但效果不是很好。

如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口盖上纱布，以减少空气中尘土等的污染。

2、时间7-8天，观察菌膜的形成、嗅味和品尝、显微镜观察PH试纸检测

课题2腐乳的制作

一、实验原理

1．参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。

2．毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。

3.毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；

脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸

（一）让豆腐长出毛霉

1.豆腐的含水量为70％左右，大于70%则腐乳不易成形。

少于70%，不利于毛霉生长。

2.将豆腐块平放在笼屉内，毛霉来自空气，现代腐乳的制作是在严格的无菌条件下，人工接种优良毛霉菌种。

3.温度保持在15～18 

℃的地方。

毛霉逐渐生长，大约5 

d后豆腐表面丛生着直立菌丝。

（二）加盐腌制：

豆腐：

盐=5：

1分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。

约腌制8 

d。

（注〕加盐腌制①腌析出水分，豆腐变硬②抑制微生物生长，③是腐乳的第一调味品④浸提出毛霉菌丝上的蛋白质

〔用盐腌制时，注意盐都用量。

盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；

盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。

）

（三）加卤汤装瓶

卤汤的成分：

酒、香辛料

卤汤的作用：

1抑制细菌和其他真菌生长的作用，调制口味

酒：

含量12%，小于12%，不杀菌；

大于12%，抑制酶活性，腐乳成熟时间会延长，影响腐乳风味。

注：

①腐乳的臭味：

臭味越浓，发酵程度越深，蛋白质在分解过程中产生了硫化氢

②“青方”：

不加辅料；

“红方”：

加红曲；

“糟方”：

加酒糟。

③除毛霉外，还有根霉、青霉、酵母菌、曲霉和细菌，它们都能起到发酵的作用

1.腐乳的“皮”，毛霉菌丝繁殖于表面形成，无害，可防止腐乳变质。

课题3制作泡菜并检测亚硝酸盐的含量

1、基础知识

1、①乳酸球菌、乳酸杆菌：

厌氧细菌②分布：

空气、土壤、植物体表，动物肠道

2、亚硝酸盐

①白色粉末，易溶于水，用于食品添加剂；

②危害0.3-0.5g人中毒,3g死亡。

标准肉：

30mg/kg，酱腌菜：

20mg/kg，儿童奶：

2mg/kg

③代谢大部分随尿排出

PH、温度、一定的微生物

亚硝酸盐亚硝胺（致癌物）

2、实验设计

（一）泡菜制作

1、清水：

盐=4：

1，将盐水煮沸冷却（除氧杀菌，冷却是避免温度高杀死乳酸菌）

2、新鲜蔬菜（亚硝酸盐含量低）：

修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状

3、腌制蔬菜半坛+香辛料至八成→加盐水至没菜→盖盖

温度过高，食盐用量不足10%，腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加

腌制中：

控制腌制时间、温度和食盐用量

4、测定亚硝酸盐含量的原理

1、见下表。

名称

原理或方法

显色反应

在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，重氮盐与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶合形成玫瑰红色染料

去杂反应

用氯化镉、氯化钡和氢氧化铝等无机颗粒吸附泡菜碎片和有机大分子

（人工）比色法

将标准比色液与显色液（实验液）进行比较，以确定显色液中亚硝酸盐的含量

专题2微生物的培养与应用

课题1微生物的实验室培养

1．培养基的类型和用途

（1）按物理状态来分：

培养基可分为固体培养基和液体培养基。

其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等，液体培养基用于工业生产。

（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。

选择培养基：

加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌

加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌

不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌

不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物

鉴别培养基

培养基中加入伊红和美蓝，鉴别大肠杆菌，菌落深紫色，带金属光泽。

以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，如PH升高，指示剂变红，则有能分解尿素的细菌

培养基中加入刚果红，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物。

当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。

2．培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐四类营养物质及生长因子，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。

3．获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。

实验室常用消毒、灭菌。

4.消毒

煮沸消毒：

100°

C煮沸5~6分钟；

巴氏消毒：

70~75°

C煮30分钟或80°

C煮15分钟；

酒精擦手；

氯气消毒水源；

紫外线；

石炭酸。

灭菌:

灼烧；

干热灭菌；

高压蒸汽灭菌

5.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤是：

计算、称量、溶化、灭菌、倒平板

溶化后要调PH（真菌：

5.0~6.0,细菌：

6.5~7.5,放线菌：

7.5~8.5）

倒平板：

①右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞（冷却到50°

C左右才能倒平板：

手触摸，刚刚不烫手）

②瓶口迅速通过火焰（通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基）

③左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿

④平板冷却，倒置（平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

问题：

在倒平板的过程中，如果不小心瘵培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？

为什么？

答：

空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

6、纯化大肠杆菌

微生物接种的方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法常用于分离菌种

稀释涂布平板法常用于统计活菌数目

思考：

⑴为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？

在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？

操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；

每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。

划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

以免接种环温度太高，杀死菌种。

⑶在作第二次以及其后的划线操作是为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

7、菌种保藏

临时保藏：

固体斜面培养基4°

C的冰箱中保藏每3-6个月换一次培养基

长期保藏：

甘油管藏的方法-20°

C甘油（防止因冷冻或水分不断升华对细胞造成损害）

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．尿素只有被细菌分解成氨之后，才能被植物吸收利用。

脲酶

CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3

2．实验室中微生物的筛选应用的原理是：

人为提供有利于目的菌生长的条件（包括

营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

1、土壤取样

3、筛选菌株：

选择培养基，以尿素为唯一N源

二、样品的稀释

4．常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释平板计数法。

即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。

另外，显微镜直接观察也是测定微生物数量的常用方法。

稀释：

细菌——104、105、106；

放线菌——103、104、105；

真菌——102、103、104

7．一般来说，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

这是因为当两个细胞或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

8．设置对照实验的主要目的是排除非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

通常设置未接种的培养基同时进行培养

三、微生物的培养与观察

9．微生物的培养与观察：

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

在实验过程中，一般每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

同种微生物表现出稳定的菌落特征，包括：

菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

10．在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是避免混淆。

11．对所需的微生物进行初步筛选，只是分离纯化菌种的第一步，要对分离的菌种进行一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。

有哪些方法可以对菌种进行鉴定？

细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，PH升高，可以检测PH。

以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红。

课题3分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素是多糖类类物质，棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

2．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和

葡萄糖苷酶，

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶

纤维素纤维二糖葡萄糖

1、纤维素分解菌的筛选

1、土壤取样①选择富含纤维素的环境；

②将滤纸埋在土壤中一个月左右，深度10CM的腐殖土壤。

也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养为了增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物

3、梯度稀释

4、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

①刚果红染色法：

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

②利用刚果红染色的方法有几种？

各自的优缺点是什么？

方法一：

先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应