人参皂苷Rb1和Re对乌头碱所致心肌细胞损伤的保护作用Word下载.docx

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乌头碱；

心肌酶谱；

钙离子通道

　　Abstract：

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofginsenosideRb1andReoninjuryoftheneonateratcardiomyocyteinducedbyaconitinealkaloids.MethodsTheinfluenceofaconitineandginsenosideRb1,Retogetherinneonateratcardiomyocytewasobservedrespectively.Theinfluenceofthesecomponentsinneonateratcardiomyocytewasexaminedbymyocardzymogram.TheexpressionofCa2+channelgeneCav1.2mRNAofneonateratcardiomyocyteaftertreatmentwasobservedbyRT-PCR.ResultsTheginsenosideRb1andRewereabletodecreasethereleaseofASTandLDH,reverseCav1.2mRNAabundanceinducedbyaconitine.ConclusionTheginsenosideRb1andRewhichtogetherwithaconitinecanalleviatethesideeffectsandboostupthetherapeuticeffectsofaconitine.TheactionmechanismmayberelationwiththattheginsenosideRb1andRecandecreaseinjuriesoftheneonateratcardiomyocytesandabundantexpressionofCav1.2mRNAinducedbyaconitine.

　　Keywords：

aconitinealkaloids；

ginsenosideRb1；

ginsenosideRe；

myocardzymogram；

Ca2+channel

　　为了探讨人参与乌头碱的相互配伍作用,了解人参各成分与乌头碱之间是否有配伍减毒的作用,笔者采用了人参皂苷Rb1和Re分别与乌头碱共同作用于乳鼠心肌细胞,观察它们对于心肌细胞心肌酶谱变化是否存在相互作用,并观察了这两种人参皂苷对于乌头碱导致的心肌细胞膜钙离子通道基因Cav1.2mRNA表达的影响。

　　1实验材料

　　1.1动物

　　出生后1～3d的Wistar大鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号：

SCXK（京）2002-0002。

　　1.2试剂和仪器

　　乌头碱（AC）、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re（中国药品生物制品检定所产品,批号分别为110720-200410、110704-200318、754-200115）,DMEM高糖（GIBCO公司）,胰蛋白酶（GIBCO公司）,胎牛血清（北京市元亨圣玛生化制品有限公司）,5-溴脱氧尿苷（Sigma公司）,培养瓶（COSTOR公司）,24孔培养板（NUNC公司）。

SABC免疫细胞化学试剂盒、MouseAnti-saconmericactin抗体、DAB染料（武汉博士德生物公司）。

Trizol-100试剂盒（GIBICO,lnvitrogenCorporation生产）,逆转录（RT）试剂盒、PCR试剂盒均为promega公司产品,购自北京华美转导科技有限公司。

倒置显微镜（奥林帕斯公司,日本）,恒温CO2培养箱（NAPCO,美国）,全自动生化检测仪（日立7600）,高速冷冻离心机（久保田3740,日本），Bio-RAD电泳仪、ABIPCR仪、Alphalmeager凝胶成像系统（AlphaInotech公司），全波长紫外/可见光扫描分光光度计（NanoDropND-1000）。

　　2实验方法

　　2.1乳鼠心肌细胞培养

　　参照文献[1]方法稍加改进,进行乳鼠的原代心肌细胞培养及传代。

取出生后1～3d的Wistar乳鼠,在无菌条件下开胸取出心脏,置于无Ca2+、Mg2+的Hank’s液中,清洗4次,去除心房及残留的血液,移入无菌小瓶中,用眼科剪刀将心室剪成1mm3的组织碎块,加入0.1%胰蛋白酶消化,8min后沉淀心肌组织,弃去首次消化的细胞悬液。

再次加入0.1%胰蛋白酶消化8min,吸取细胞悬液移入另一装有少量20%FCS/DMEM培养基的离心管中终止消化,1200r/min离心10min,弃上清液,加入完全培养液,悬起细胞。

此步骤重复6～8次,直至组织块消失。

合并所有细胞悬液,100目筛网过滤后,再次离心收集细胞。

用含有20%胎牛血清的DMEM将细胞悬起,转入25cm2培养瓶中,置于5%CO2、37℃培养箱中培养2h,以差速贴壁的方法去除非心肌细胞,加入含有5-溴脱氧尿苷（0.1mmol/L）的完全培养基稀释细胞悬液,平均分入若干培养瓶后继续培养,36h后换液。

倒置显微镜观察细胞生长状况及细胞博动情况,待细胞长满后,用浓度为0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA-Na2的消化液进行消化传代,以试验所需密度传入24孔板中,继续培养24h左右,即可用于试验。

　　2.2心肌细胞的鉴定

将分离的心肌细胞接种于6孔细胞培养板,培养48h后用4%多聚甲醛固定,采用鼠抗α-sacomericactinantibody及SABC免疫组化染色试剂盒对心肌细胞中特有的横纹肌肌动蛋白进行定位,对心肌细胞鉴定,同时确定心肌细胞纯度。

　　2.3人参皂苷Rb1和Re对由乌头碱导致的心肌细胞损伤的保护作用

　　将原代培养的心肌细胞按5×

104cells/孔的密度传代至24孔板中,培养12h,更换成含有2%FCS的DMEM培养液。

继续培养12h后,分为4组加药：

不加药物空白细胞对照组空白组、0.3mmol/L乌头碱单独作用组、0.1mmol/L人参皂苷Rb1和0.3mmol/L乌头碱共同作用组、0.1mmol/L人参皂苷Re和0.3mmol/L乌头碱共同作用组。

作用24h后取上清液,全自动生化检测仪检测心肌酶谱的变化。

　　2.4人参皂苷Rb1和Re对由乌头碱导致的心肌细胞钙离子通道基因Cav1.2mRNA表达上调的影响

　　将原代培养的细胞按2×

108cells/L密度传代至6孔板中,培养24h后,分为4组进行加药：

不加药物空白细胞对照组、0.1mmol/L乌头碱单独作用组、0.1mmol/L乌头碱组与0.1mmol/L人参皂苷Rb1共同作用组、0.1mmol/L乌头碱与0.1mmol/L人参皂苷Re共同作用组。

作用8h后,用PBS冲洗3次,用TRizol一步法提取心肌细胞的总RNA：

每5×

105cells加Trizol0.8mL,吹打均匀；

加0.16mL氯仿摇匀,12000r/min离心15min；

上清移至新管,加0.4mL异丙醇,12000r/min离心10min；

弃上清,加75%乙醇1mL,清洗,离心7min（10000g）。

DEPC·

H2O溶解RNA。

1%琼脂糖凝胶电泳观察18s与28s条带密度比值约等于2,确保RNA的纯度和完整性。

将RNA进行琼脂糖凝胶电泳,并检测其纯度及浓度。

各总RNA样本OD260/OD280的比值均为1.8～2.0。

取1.5μg上述总RNA产物,用promega逆转录酶,按照产品说明书操作,总反应体系为25μL。

　　引物序列与合成：

Cavl.2,GAPDH序列,上海生工生物工程有限公司合成。

　　Cav1.2引物序列：

上游引物序列5’-GTCATCATCATCTATGCCATT-3；

下游引物序列5’-GCG-GCTGAACTTGGATT-3。

扩增片段长度680bp。

GAPDH引物序列：

上游引物序列5’-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3,下游引物序列5’-CTGGGGGCATCGGCAGAAGG-3。

扩增片段长度251bp。

PCR反应体系：

2μLcDNA,0.3μLpromegaTaq,25mmol/LMgC121.2μL,上下游引物各0.8μL。

2μL10×

PCRBuffer。

加入DEPC·

H2O至20μL。

　　GAPDH扩增条件：

预变性94℃,2min；

94℃,20s,58℃,30s,72℃,45s；

终末延伸72℃,10min。

30cycles。

Cav1.2扩增条件：

预变性95℃,2min；

95℃,30s,55℃,45s,72℃,45s；

35cycles。

　　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,照相并进行半定量分析。

基因的表达水平以Cav1.2与GAPDH的光密度比值来推断。

每组PCR反应至少重复3次以获得平均值。

　　2.5统计学方法

　　所有数据均采用SPSS11.0统计软件处理,数据用x±

s表示。

　　3结果

　　3.1心肌细胞培养的形态学观察

　　分离出来的心肌细胞孵育36h后更换培养液,倒置显微镜下即可观察贴壁心肌细胞的生长状况。

心肌细胞贴壁后逐渐展开,形态多样,从圆形到梭形、三角形、星形、多角形,并可以见到单个细胞搏动,频率较快,40～80次/min。

换液后24h,多个临近的细胞伸出伪足交联形成细胞簇,单个细胞搏动转变为细胞簇搏动,最后多个细胞簇同步搏动,频率80～130次/min。

这时的细胞即可用于实验。

　　3.2心肌细胞的鉴定

　　采用分离培养后的Wistar乳鼠心肌细胞,培养3d后,根据心肌细胞中所含有的各种蛋白特性,我们将其特有的横纹肌肌动蛋白（MouseAnti-saconmericactin）作为检测鉴定指标,采用免疫细胞化学法对所培养的心肌细胞进行鉴定。

根据检测结果,在培养的细胞中,凡被DAB染上棕黄色的细胞,均为心肌细胞,随即对5个显微镜视野中细胞总数和心肌细胞数量进行计算,心肌细胞纯度达到90%左右。

　　3.3人参皂苷Rb1和Re对乌头碱导致的心肌细胞损伤的作用

　　3.3.1人参皂苷Rb1和Re与乌头碱共同作用对培养大鼠心肌细胞心肌酶谱变化的影响

　　（见表1）表1人参皂苷Rb1和Re对乌头碱诱导的乳鼠心肌细胞心肌酶谱变化的影响（略）注：

与乌头碱组比较,*P&

lt;

0.05,**P&

0.01。

　　3.3.2人参皂苷Rb1和Re