兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定Word文档格式.docx

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6.-8C,12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白；

7.透析法除残余有机溶剂小分子；

8.凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK

9.pH比色法测定酶活性；

10.Aaso光吸收法测定酶浓度；

11.酶的动力学参数（Ka,Vmax）的测定；

12.CK的DTNB修饰反应动力学；

13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定；

14.SDS-PAGE®

定亚基的分子质量和CK纯度；

15.凝胶层析测定CK分子质量。

实验原理：

肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个

与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。

肌酸激酶可逆地催化

肌酸与ATP之间的转磷酰基反应：

CK

CH3

、脑型（BB）、杂化型（MB）和线粒体

BB型主要存在于脑细胞中，MB型主

型（MiMi）。

MM型主要存在于各种肌肉细胞中,

要存在于心肌细胞中，而MiMi型存在于线粒体内膜上。

前3种肌酸激酶为胞浆肌酸激

酶。

细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。

但动物体内贮存能量的高能物质不是

ATP而是磷酸肌酸。

能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制（creatinephosphaateshuttle）

来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。

氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶（translocase）的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位（I）,线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，

变成ADP和高能物质磷酸肌酸（H）。

磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维（myofibrils）,

肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶（川），这样，当肌肉收缩时，需要大量的

ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP，而反应产生的肌酸再扩散回

线粒体，重新磷酸化（W）。

肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。

肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。

在催化过程中，该酶的最小功能单位是亚基，亚基在二聚体中独立地起催化作用。

根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子质量为43OOOu

左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。

天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。

根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25%-30%的a-螺旋，15%左右的3

-折叠。

肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby法。

该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。

肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）：

肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的

H+，其最适pH为7.5-9.0，在此范围内测定H+的生成速度，可以作为酶活力的指标。

本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的

活性，即在597nm波长下，监测吸光度的变化。

在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶

液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。

在pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。

配制方法见试剂部分。

测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10』酶溶液，迅速盖盖，混

匀后立即监测597nm处光吸收的变化，每15秒或30秒读一次吸光度值（A597），共读取8个数据点，用A597对时间作图，从图中求出每min吸光度值的变化，即△A597。

并按下式计算酶的比活力（U）：

U=1.3A597―VA稀释倍数（mol/（min*mg））

C2b

其中：

1.3为吸光度的变化换算成H+的系数。

Va=1.0ml（底物溶液），

Vb=0.01ml（加入的酶溶液）。

C:

加入酶溶液的浓度。

酶溶液浓度C的测定按其在280nm处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为E1%1cm=8.8。

即:

C=如10稀释倍数

8.8

四、试剂：

1.KCI:

0.01mol/L,200ml。

（0.15gKCI加水至200ml）

2.NH4OH:

1.7mmol/L,1000ml。

（取0.12ml浓氨水，加H2O至1000ml）

3.柠檬酸铵：

0.05mol/L,pH9.0,1000ml。

（称12.15g溶于1000mlH2O）

4.Tris-HCl:

0.1mol/L,pH8.0,1000ml。

（称Tris12.1g，取HCl23ml，调pH为8.0,加水至1000ml）

5.NH4CI:

研细，10g。

6.NH40H:

5mol/L,100ml（公用）

7.MgSO4：

2.0mol/L,pH8.5,20ml。

（公用）

8.MgAC2:

0.07mol/L,pH9.0,100ml。

9.NaOH:

0.2,0.5,1.0,2.0,5.0（mol/L）。

10.HAc:

0.2mol/L。

11.95%CH3CH2OH（乙醇）

12.粗盐

13.底物溶液的配制：

通常一次配制20ml，当天使用。

配制方法：

取10ml48mmol/L的肌酸溶液，加入1.0mlO.1mol/L的MgAC2,2.0ml0.1%的百里酚蓝（称100mg百里酚蓝，加20ml乙醇溶解后再加水60ml）,1.0ml0.1mol/LpH9.0的Gly-NaOH缓冲液，称48mgATP溶于此溶液，再补加水5.0ml，用0.1〜0.2mol/LNaOH仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.8〜2.2）即可。

五、实验步骤：

（一）、兔肌肌酸激酶的分离纯化：

1.将兔子化冻后取大腿肌50g,去除结缔组织和神经后剪碎。

加200ml0.01mol/LKCl,

用组织打碎机（或食品加工机）和高速分散器各粉碎3次以上，每次不超过30s,以防过热。

2.冰浴搅拌提取15-30min，用8000r/min,0C,离心10min，弃去沉淀，测上清体积为W,取样0.5ml。

V1=81.0ml。

3.在其余上清中加入研细的NH4CI至浓度为0.1mol/L（逐滴加入）。

加入的NH4CI的量：

Mnh4ci=5.35XV1=0.431g。

用5moI/LNH4OH调pH至9.0（最适pH值）,冰浴搅拌30min（0C）。

4.加入1.5倍V1体积的95%冷乙醇，20C搅拌2.5h。

以热变性法用60%的有机溶剂变性除杂蛋白。

1.5V1=121.50mI

—8C,8000r/min离心10min。

弃沉淀，测上清液体积为V2,取样0.5ml。

V2=155.5ml

5.其余上清液中加入Vaml的2mol/LMgSO4（pH=8.5），至终浓度为0.03moI/L。

VA2

A0.03,VA=2.37mI

VaV2

1.5VA=3.55mI

再补加1.5VA体积的95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌30min，—8C,8000r/min离

心10min，弃去上清。

6.沉淀加1/10V1体积的MgAc2（0.07moI/L,pH=9.0）溶解悬浮（冰浴）。

冰浴搅拌1h

后，0C,12000r/min离心10min，弃去沉淀，测上清体积为V3，取样0.5ml。

V3=13.2ml

7.其余上清液用0.5-1mol/LNaOH调pH=8.0。

置冰盐浴内缓慢加入Vb体积的95%的

冷乙醇至终浓度为36%。

VB的计算式：

（V3-MgAC2的加入量厂0.6+V0.36

V3+Vb

本实验中：

VB=2.64ml。

8.搅拌30min后，—8C,12000r/min离心10min，弃去沉淀，测上清体积为V，取样0.5ml。

V4=14.5ml.

9.其余上清置于冰盐浴中，缓慢加入Vc体积的95%的冷乙醇至终浓度为50%。

Vc的计算式：

乂°

.36+%=0.5

V4+Vc

本实验中Vc=4.06ml。

10.搅拌30min后，—8C,12000r/min，离心10min，弃上清，沉淀溶于4mlpH9.0

0.05mol/L的柠檬酸铵溶液，即为V5,取样0.2ml。

（以NH4OH调pH值）

V5=4.6ml.

11.对此缓冲液透析过夜。

透析袋内加液量控制在1/2到1/3左右，最外面加上冰浴，

每小时换一次缓冲液，4-5h。

12.再对1.7mmol/L的NH4OH透析，0C,12000r/min离心10min，弃去沉淀，测上清体积为V6，取样0.5ml。

V6=4.5ml.

13.其余的V6溶液用此NH4OH透析液调蛋白的质量浓度约为5g/L后用恒流泵上样至

DEAE-52离子交换层析柱，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平。

将上样时未被吸附液和冲洗前阶段液体收集，得穿过峰体积，即为V8。

取样

0.5ml。

14.用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶，收集活性峰（峰管测活），合并得到V7样品,

取样0.5ml，其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。

离子交换柱层析：

取约10mL湿的DE-52阴离子交换纤维素，抽干后在0.5mol/LNaCl-NaOH

溶液中浸泡30min，水洗至中性，在0.5mol/LHCl中浸泡30min，水洗至中性，

在0.5mol/LNaOH中浸泡30min，水洗至中性抽干，然后再用0.01mol/LpH8.0

Tris-HCI平衡缓冲液浸泡过夜。

在本次实验中，我们使用的柱子是做过一次兔肌肌酸激酶分离的旧柱子，所

以直接用50ml1moI/LNaCI上泵洗柱，再用0.01mol/LpH8.0Tris-HCI平衡缓冲液平衡。

最终柱高约4cm。

凸形梯度洗脱液体系：

Ci（混合瓶）：

0.01mol/L，pH8.0，Tris-HCl，50ml，（瓶塞不漏气）；

C2（贮液瓶）：

0.10mol/L,pH8.0，Tris-HCl，150ml；

洗脱速度：

0.2-0.3ml/min；

收集体积：

2-3ml/管/10-15min。

从上样开始收集，洗脱完毕，逐管测定A280。

选择A280较大的管测活，绘制洗脱图。

凸形梯度洗脱用在此处的优点：

在前几十管分离杂蛋白时，盐梯度增长很快，

而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时，盐梯度变化缓慢，