兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定Word文档格式.docx

1、6.-8 C, 12000r/m高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白；7.透析法除残余有机溶剂小分子；8.凸形梯度洗脱和 DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白 CK9.pH比色法测定酶活性；10.Aaso光吸收法测定酶浓度；11.酶的动力学参数（Ka, Vmax）的测定；12.CK的DTNB修饰反应动力学；13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定；14.SDS-PAGE定亚基的分子质量和 CK纯度；15.凝胶层析测定CK分子质量。实验原理：肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、 ATP再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化肌

2、酸与ATP之间的转磷酰基反应：CKCH3、脑型（BB）、杂化型（MB）和线粒体BB型主要存在于脑细胞中， MB型主型（MiMi）。MM 型主要存在于各种肌肉细胞中,要存在于心肌细胞中，而 MiMi型存在于线粒体内膜上。前 3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶。细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生 ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制 （creatine phosphaate shuttle）来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生 的ATP在ATP-ADP转位酶（translocase）的帮助下被直接送到位于线

3、粒体内膜外侧的线粒 体型肌酸激酶所在部位 （I）,线粒体型肌酸激酶将 ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸（H）。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维 （myofibrils）,肌原纤维的M-区带上结合了肌肉型肌酸激酶（川），这样，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为 ATP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化（W）。肌酸激酶同工酶具有重要的生理功能和医学应用价值。肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。在催化过程中，该酶的最 小功能单位是亚基，亚基在二聚体中独立地起催化作用。根据目前已经测定的兔、人、 鸡、鼠肌酸激酶的

4、一级结构， M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子质量为 43 OOOu左右，分子内有 8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有 25 %-30 %的a -螺旋，15 %左右的3-折叠。肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的 Kuby法。该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是 pH-比色法。肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）：肌酸激酶在催化正向反应时，随着 ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H +，其最适pH为7.5-9.0，在此范围内测定 H+的生成速度，可以作为酶活力的指标。 本实验采用百里酚蓝作

5、为 pH指示剂，在分光光度计上通过 pH-比色法测定肌酸激酶的活性，即在597nm波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的 H+使溶液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色， 吸光度值A597不断降低。在pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。配制方法见试剂部分。测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入 10酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm处光吸收的变化，每15秒或30秒读一次吸光度值（A 597 ），共读取 8个数据点，用 A597对时间作图，从图中求出每 min吸光度值的变化，即 A597。并按 下式计算酶的比活力（U）：U = 1.

6、3 A597VA 稀释倍数 （mol / （min *mg）C 2b其中：1.3为吸光度的变化换算成 H +的系数。Va =1.0ml （底物溶液），Vb =0.01ml （加入的酶溶液）。C:加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度C的测定按其在280nm处的吸光度值来确定，其百分吸光 系数为 E1% 1cm=8.8。即: C=如10稀释倍数8.8四、 试剂：1.KCI : 0.01mol/L, 200ml。 （0.15g KCI 加水至 200ml）2.NH4OH : 1.7mmol/L , 1000ml。（取 0.12ml 浓氨水，加 H2O 至 1000ml）3.柠檬酸铵：0.05mol/L ,

7、pH9.0 , 1000ml。（称 12.15g 溶于 1000ml H 2O）4.Tris-HCl : 0.1mol/L , pH8.0 , 1000ml。（称 Tris 12.1g，取 HCl 23ml，调 pH 为 8.0, 加水至1000ml）5.NH4CI:研细，10g。6.NH40H : 5mol/L , 100ml （公用）7.MgSO4： 2.0mol/L , pH8.5, 20ml。（公用）8.MgA C2: 0.07mol/L , pH9.0 , 100ml。9.NaOH : 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0（ mol/L ）。10.HAc : 0.2mol/

8、L。11.95% CH3CH2OH （乙醇）12.粗盐13.底物溶液的配制：通常一次配制20ml，当天使用。配制方法：取 10ml 48mmol/L 的肌酸溶液，加入 1.0ml O.1mol/L 的 MgAC2,2.0ml 0.1 % 的百里酚蓝（称100mg百里酚蓝，加20ml乙醇溶解后再加水 60ml） ,1.0ml 0.1mol/L pH9.0 的Gly-NaOH 缓冲液，称48mg ATP溶于此溶液，再补加水5.0ml，用0.10.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为 1.82.2）即可。五、 实验步骤：（一）、兔肌肌酸激酶的分离纯化：1.将兔子化冻后取大腿

9、肌 50g,去除结缔组织和神经后剪碎。 加200ml 0.01mol/L KCl ,用组织打碎机（或食品加工机）和高速分散器各粉碎 3次以上，每次不超过30s,以防 过热。2.冰浴搅拌提取15-30min，用8000r/min , 0C,离心10min，弃去沉淀，测上清体积 为W,取样0.5ml。V1=81.0ml 。3.在其余上清中加入研细的 NH4CI至浓度为0.1mol/L （逐滴加入）。加入的 NH4CI 的量：Mnh4ci=5.35 X V1=0.431 g。用 5moI/L NH 4OH 调 pH 至 9.0 （最适 pH 值）,冰浴搅拌 30min （0C）。4.加入1.5倍V1

10、体积的95%冷乙醇，20C搅拌2.5h。以热变性法用 60%的有机溶剂 变性除杂蛋白。1.5V1=121.50mI8C, 8000r/min 离心 10min。弃沉淀，测上清液体积为 V2,取样0.5ml。V2=155.5ml5.其余上清液中加入 Va ml的2 mol/L MgSO 4（pH=8.5），至终浓度为 0.03moI/L。VA 2A 0.03, VA=2.37mIVa V21.5VA=3.55mI再补加1.5 VA体积的95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌 30min， 8C, 8000r/min离心10min，弃去上清。6.沉淀加1/10 V1体积的MgAc2 （0.07moI/L ,

11、 pH=9.0）溶解悬浮（冰浴）。冰浴搅拌1h后，0C, 12000r/min离心10 min，弃去沉淀，测上清体积为 V3，取样0.5ml。V3=13.2ml7.其余上清液用0.5-1mol/L NaOH 调pH=8.0。置冰盐浴内缓慢加入 Vb体积的95%的冷乙醇至终浓度为 36%。VB的计算式：（V3- MgAC2的加入量 厂0.6+ V 0.36V3+ Vb本实验中：VB=2.64ml 。8.搅拌30min后，8C, 12000r/min离心10 min，弃去沉淀，测上清体积为 V，取 样 0.5ml。V4=14.5ml.9.其余上清置于冰盐浴中，缓慢加入 Vc体积的95 %的冷乙醇至

12、终浓度为 50%。Vc的计算式：乂 .36+ % = 0.5V4 + Vc本实验中Vc=4.06ml。10.搅拌 30min 后，8C, 12000r/min，离心 10 min，弃上清，沉淀溶于 4ml pH 9.00.05mol/L的柠檬酸铵溶液，即为 V5,取样0.2ml。（以NH4OH调pH值）V5=4.6ml.11.对此缓冲液透析过夜。透析袋内加液量控制在 1/2到1/3左右，最外面加上冰浴，每小时换一次缓冲液，4-5h。12.再对1.7mmol/L的NH4OH透析，0C, 12000r/min 离心10 min，弃去沉淀，测上 清体积为V6，取样0.5ml。V6=4.5ml.13.

13、其余的V6溶液用此NH4OH透析液调蛋白的质量浓度约为 5g/L后用恒流泵上样至DEAE-52离子交换层析柱，用0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平。将上样时未被吸附液和冲洗前阶段液体收集，得穿过峰体积，即为 V8。取样0.5ml。14.用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶， 收集活性峰（峰管测活），合并得到V7样品,取样0.5ml，其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。离子交换柱层析：取约10mL湿的DE-52阴离子交换纤维素，抽干后在 0.5mol/L NaCl-NaOH溶液中浸泡 30min，水洗至中性，在0.5mol/L HCl中浸泡30min，水洗至中

14、性，在0.5mol/L NaOH 中浸泡30min，水洗至中性抽干，然后再用 0.01mol/L pH8.0Tris-HCI平衡缓冲液浸泡过夜。在本次实验中，我们使用的柱子是做过一次兔肌肌酸激酶分离的旧柱子， 所以直接用 50ml 1moI/L NaCI上泵洗柱，再用 0.01mol/L pH8.0 Tris-HCI 平衡缓冲 液平衡。最终柱高约 4cm。凸形梯度洗脱液体系：Ci （混合瓶）：0.01 mol/L，pH8.0，Tris-HCl，50ml，（瓶塞不漏气）； C2 （贮液瓶）：0.10mol/L, pH8.0，Tris-HCl，150ml ； 洗脱速度：0.2-0.3ml/min ； 收集体积：2-3ml/ 管/10-15min。从上样开始收集，洗脱完毕，逐管测定 A280。选择A280较大的管测活，绘制洗脱图。凸形梯度洗脱用在此处的优点： 在前几十管分离杂蛋白时， 盐梯度增长很快，而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时，盐梯度变化缓慢，