免疫组化非标记免疫酶法PAPWord格式.docx

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包括酶桥法（EnzymeBridgeMethod）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PeroxidaseAntiperoxidaseMethod,PAP法）。

现分述如下。

（一）酶桥法

　　1．基本原理　　首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。

在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节　省第一抗体的用量。

　　2．染色步骤主要程序如图4-4

能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg（RZ=3.0）];

间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；

再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。

再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为1：

128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。

（2）制备PAP复合物：

离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。

在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。

　　【步骤】

　　①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。

　　②混匀，室温1h后，离心16000g4℃15min。

　　③0.9%NaCl（冷盐水）溶解沉淀，离心16000g4℃15min，重复4次。

　　④加15.3mlHRP水溶液（含HRP30.64mg），室温，持续搅拌。

　　⑤用1NHCl及0.1NHCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N及0.1nNaOH调pH至7.2。

　　⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。

　　⑦离心35000g0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。

　　⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6gNaCl,1.5NNaOOCCH330ml,3N（NH4）2SO430ml,水5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。

PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。

PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：

2。

应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：

PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：

2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。

采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm。

这种结构异常稳定。

据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。

　　2．PAP染色原理及步骤

（1）原理：

与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。

PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。

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（2）染色步骤：

主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。

　　①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；

切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。

　　②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。

图4-5　PAP法主要染色步骤

　　③用离体制得的PAP复合物（1：

30～300稀释）孵育1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。

亦可用ALP抗ALP复合物代替。

　　④显色观察等同间接法。

　　3．PAP法的评价　　PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。

其主要特征和注意事项如下：

（1）抗体活性高：

非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。

（2）灵敏度高：

灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。

从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：

1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。

假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。

我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；

但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。

据此，Sternberger（1979）认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节　省其用量。

但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。

笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。

其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。

另外，PAP复合物分子量较大（400KD）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。