中药化学实验讲义Word文档格式.docx

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1．掌握硅胶薄层板的制备及薄层层析的操作方法

2．掌握硅胶薄层活度的测定方法

3．应用薄层层析法检测识中草药化学成分

二、实验材料

薄层层析用硅胶G，硅胶F，羧甲基纤维素钠，0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow.P-Dimethylaminoazobenzene），苏丹红（SudanⅢ），靛酚蓝（Indophenolblue4-Tapnthoquinone-4-dimethylaminoaniline），苯，微量点样管，10×

20cm玻璃板20块，碾钵7套。

三、实验操作

（一）薄层板的制备

1．硅胶薄层的制备

（1）硅胶G薄层取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。

活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。

（2）硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层CMC-Na系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。

羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5~1%浓度（常用0.8%），宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。

取薄层层析用硅胶，按1：

3~3.5的比例加入羧甲基纤维素钠溶液顺时针方向搅拌混合并排除气泡，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，让其自然阴干，100℃下活化30分钟。

活化温度不应过高，防止碳化。

冷后于干燥器内备用。

注：

国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：

硅胶G（G是Gypsum石膏的缩写。

表示加了石膏），硅胶H（H表示不加石膏），硅胶GF254（F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰）。

硅胶GF365（表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉）。

2．特殊薄层的制备

根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。

（1）酸、碱薄层和pH缓冲薄层

为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铅薄层使用，硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1~0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。

当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺层，制成一定pH缓冲的薄层。

（2）络合薄层

硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。

也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。

（二）、吸附剂的活度测定

1．硅胶活度的测定

一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。

欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow.P-Dimethylaminoazobenzene）。

苏丹红（SudanⅢ），靛酚蓝（Indophenolblue4-Tapnthoquinone-4-dimethylaminoaniline）的苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm（约20分钟），三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线。

二甲基黄斑点在薄层的当中。

苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。

2．氧化铝活度的测定

一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。

染料试剂的配制：

取偶氮苯（Azobenzene）50mg，对甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene）,苏丹黄（SudanI,Benzeneazo-β-naphthol），苏丹红（SudanⅢTetrazobenzol-β-naphthol），对氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene）各20mg，分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳（经氢氧化钠干燥）中。

常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°

之间，展开后测出各斑点的Rf值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。

另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。

观察有无变化。

表1氧化铝活度与偶氮染料外值关系

偶氮染料

氧化铝活度级Rf值

二级

三级

四级

五级

偶氮苯

0.59

0.72

0.85

0.95

对甲氧基偶氮苯

0.16

0.45

0.69

0.89

苏丹黄

0.02

0.25

0.87

0.98

苏丹红

0.00

0.10

0.35

0.50

对氨基偶氮苯

0.05

0.08

0.19

（三）、薄层层析的应用

薄层层析法在中药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。

用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。

由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。

实验操作：

蒽醌类成分的鉴别

三、思考题

1.为何在铺板之前，色谱用的玻璃板要完全洗净并干燥？

2.为何铺好的TLC板用前要在烘箱中干燥？

试验二大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

（一）概述

大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。

自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。

大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（RheumpalmatclmL），大黄（R.officinaleBaill）及唐古特大黄（R.tangutiumMaxim.etRegll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。

已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：

R1

R2

名称

晶形

熔点

-H

-COOH

大黄酸（Rhein）

黄色针晶

318~320℃

-CH2OH

芦荟大黄素（Aloe-emodin）

橙色细针晶

206~208℃

-CH3

大黄酚（Chyrsophanol）

金色片状结晶

196℃

-OH

大黄素（Emodin）

橙色针晶

256~257℃

-

大黄素甲醚（Physcion）

砖红色针晶

207℃

大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。

大黄酸连有-COOH，酸性最强；

大黄素连有β-OH，酸性第二；

芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；

大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。

（二）实验目的和要求

1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。

2．掌握PH梯度法的原理及操作技术。

3．学习蒽醌类化合物鉴定方法。

（三）实验方法

实验试剂及试药：

大黄药材粗粉2Kg，氯仿500ml10瓶，浓硫酸2瓶，冰醋酸，乙醚，苯，乙酸乙酯，碳酸钠（5%Na2CO3溶液3000ml），碳酸氢钠（5%NaHCO3溶液3000ml），氢氧化钠（5%NaOH溶液1000ml），氢氧化钾，醋酸镁试剂，

实验仪器设备：

500ml圆底烧瓶15个，冷凝回流管15只，500ml-1000ml分液漏斗15只，500ml烧杯30只，100-250ml量筒15只，常压漏斗（5-10cm斗径15只），定性滤纸（10cm）2盒，毛细管点样器1盒，玻璃喷瓶4套，广谱PH试纸7盒，纱布一卷

多孔水浴锅，旋转蒸发仪

1．大黄总蒽醌苷元的提取

注意：

①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合，以蒽醌的形式存在于植物组织中。

所以要用酸水解使其生成苷元。

蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；

②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。

氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。

2．总蒽醌苷元的分离与精制

大黄酸的分离与精制

将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲液（5%NaHCO3溶液）275ml振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml烧杯中，加HCl酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。

大黄素的分离与精制

将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液（5%NaCO3溶液）275ml振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。

芦荟大黄素的分离和精制

余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:

5%NaOH（9:

1）碱水液540ml或用0.5%KOH540ml振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。

3.鉴定

1.化学检识：

分别取总蒽醌提取物少许，用乙醚溶解，做如下反应：

A：

碱液试验：

取试液1ml，加20%NaOH数滴，观察颜色。

B．醋酸镁反应：

取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。

2．薄层鉴定：

吸附剂：

硅胶-CMC

展开剂：

C6H6-EtOAc（3:

2或97：

9）。

显色剂：

（1）氨蒸气熏。

（2）5%KOH喷雾。

（四）实验指导

1．本实验讲解要点及注意事项。

①PH梯度萃取的原理及注